神經(jīng)氨酸酶天然產(chǎn)物抑制劑的作用模式研究和虛擬篩選.pdf

1、流感是由流感病毒引起的呼吸道傳染病，具有傳播快和發(fā)病率高等特點。每年的季節(jié)性流感可致30-50萬人死亡，而流感的世界大流行曾導(dǎo)致上億人感染和數(shù)千萬人死亡。流感病毒是一種正粘病毒科RNA病毒，分為A、B和C三種亞型（或甲、乙和丙型），其中僅A型能引起流感世界大流行。根據(jù)A型流感病毒表面的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶(NA)不同，將其命名為HxNy。
　　 由于NA在流感病毒復(fù)制中具有重要生物學作用，且其活性口袋在不同亞型流感病毒中具

2、有保守性，NA被作為抗流感病毒藥物研發(fā)的重要靶點之一。目前，神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAI)是臨床上最有效的抗流感病毒藥物，在2013年我國的H7N9禽流感疫情中，3個NAI被作為抗流感病毒的有力武器，分別是口服藥奧司他韋（商品名“達菲”）、吸入粉霧劑扎那米韋（商品名“樂感清”）和注射劑帕拉米韋（商品名“力韋”）。
　　 迄今確定的NA亞型有9種，基于系統(tǒng)分析法可將其分為兩組，組1包括N1、N4、N5、N8，組2包括N2、N3、N6、

3、N7、N9，兩組NA在“150-環(huán)”和“150-空腔”處存在明顯結(jié)構(gòu)差異。但同屬于組1 NA的09N1(來自2009H1N1)在“150-環(huán)”處的結(jié)構(gòu)更類似于組2 NA。隨著流感病毒的不斷變異和耐藥性問題的愈演愈烈，加速開發(fā)新型、抗耐藥性NAI變得刻不容緩，而基于09N1結(jié)構(gòu)的NAI發(fā)現(xiàn)和機制探索可能為新型NAI的研發(fā)提供新思路。
　　 據(jù)統(tǒng)計，在1981-2010年間注冊的抗病毒新化學實體中，80％是天然產(chǎn)物及具有天然產(chǎn)物骨架

4、的衍生物，且近年來關(guān)于天然產(chǎn)物NAI的研究也遠超過化學合成NAI。我國是中藥使用大國，在抗流感病毒方面，中藥也發(fā)揮著重要的作用。為使中藥走向國際化，需加速中藥現(xiàn)代化進程，而闡明中藥發(fā)揮藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制一直是關(guān)鍵和難點。計算機輔助藥物設(shè)計(CADD)在闡明分子間相互作用方面有獨到之處，可作為從抗流感中藥寶庫中發(fā)掘活性成分并闡明其作用機制的有利工具。
　　 本研究充分利用蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)中有關(guān)NA的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，從文

5、獻中收集有關(guān)天然產(chǎn)物NAI、抗流感中藥化學成分等化合物的結(jié)構(gòu)和活性信息，綜合運用CADD的多項理論和技術(shù)，首先對GOLD和Surflex-Dock這兩個分子對接軟件的09N1體系對接效果進行評價，然后基于分子對接探討09N1天然產(chǎn)物抑制劑(天然產(chǎn)物09NAI)的作用模式;構(gòu)建09N1抑制劑(09NAI)的藥效團模型;基于藥效團搜索、類藥性評價和分子對接對中藥化學數(shù)據(jù)庫(TCMD)和自建的抗流感中藥化學成分數(shù)據(jù)庫(AICMD)進行虛擬篩選

6、，以發(fā)現(xiàn)潛在的新型NAI。
　　 目的:利用分子對接技術(shù)，在分子水平揭示天然產(chǎn)物09NAI與NA的作用模式;基于上市藥物的結(jié)構(gòu)特征和作用模式，構(gòu)建09N1抑制劑的藥效團模型;構(gòu)建抗流感中藥化學成分數(shù)據(jù)庫(AICMD);對TCMD和AICMD進行虛擬篩選，以得到潛在的新型NAI。
　　 方法:
　　 1、利用分子對接軟件GOLD和Surflex-Dock分別將09N1-NAI晶體結(jié)構(gòu)中的配體對接回原09N1，根據(jù)對

7、接構(gòu)象的RMSD值和關(guān)鍵氫鍵重現(xiàn)率（用KISS Score表示）兩個指標來評價分子對接方法的可靠性。
　　 2、收集天然產(chǎn)物09NAI，利用分子對接探討這些化合物的作用模式以及它們與上市NAI的作用模式異同。
　　 3、依據(jù)上市09NAI的結(jié)構(gòu)特征和NA-NAI晶體結(jié)構(gòu)中蛋白-配體間的相互作用，構(gòu)建09NAI的藥效團模型。
　　 4、基于藥效團搜索、類藥性評價和分子對接等技術(shù)，對TCMD進行虛擬篩選。
　　

8、 5、根據(jù)文獻統(tǒng)計臨床和實驗研究中抗流感單味藥出現(xiàn)頻率的高低，依次收集單味藥的化學成分，構(gòu)建AICMD，并對其進行虛擬篩選。
　　 結(jié)果:
　　 1、分子對接軟件GOLD和Surflex-Dock得到的所有配體對接構(gòu)象與晶體結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象的RMSD值都小于2.5(A)，且每個配體的得分最高構(gòu)象均有較高KISS Score值。以RMSD和KISS Score為評價標準，比較GOLD的兩個打分函數(shù)Gold Score和Ch

9、em Score，發(fā)現(xiàn)基于Gold Score所得的對接結(jié)果更好。
　　 2、收集了10個天然產(chǎn)物09NAI，分子對接結(jié)果顯示，它們都與NA活性位點S1區(qū)的Arg371、Arg292或Arg118形成氫鍵或靜電作用，從中總結(jié)出5個與S1區(qū)相互作用的結(jié)構(gòu)片段，即黃酮類母核結(jié)構(gòu)5-羥基色原酮和2-羥基苯乙酮、苯基脂肪酮(苯基與羰基間碳原子數(shù)為1～3)、鄰苯二酚類和1，3-丙二酮。與其他09NAI不同，化合物katsumadain A

10、主要以范德華力和疏水作用力同NA結(jié)合，而不是氫鍵或靜電作用?；谶@10個09NAI構(gòu)建了一個4點藥效團模型，包含兩個氫鍵受體，可與S1區(qū)形成氫鍵作用;兩個疏水中心，其中一個對應(yīng)于09NAI的母核結(jié)構(gòu)，另一個疏水中心與氫鍵受體毗鄰，可與“430-環(huán)”處殘基形成疏水作用。
　　 3、基于4個上市09NAI在結(jié)構(gòu)和作用模式上的異同，構(gòu)建了4個09NAI的藥效團模型，其中一個3點藥效團模型（模型1），包含一個氫鍵受體/負電中心、一個氫鍵

11、給體/正電中心和一個氫鍵受體;兩個4點藥效團模型（模型2和3），除包含3點模型中所有藥效特征基團外，還各自包含一個疏水中心或一個氫鍵受體;一個5點藥效團模型(模型4)，包含兩個4點藥效團模型的所有藥效特征基團。
　　 4、從TCMD中篩得50個得分較高的化合物中包含硫苷類、黃酮類、酚類、甜菜黃素類、生物堿類和蒽酮類等結(jié)構(gòu)類型，其中硫苷類化合物得分最高，遠超過ZMR。所有化合物都與NA中S1區(qū)形成氫鍵或靜電作用，其中與S1區(qū)相互作

12、用的結(jié)構(gòu)片段包括硫酸酯基、羧基、黃酮類母核和苯酚結(jié)構(gòu)。值得注意的是，篩得的生物堿AL2主要以范德華力和疏水作用力同NA結(jié)合。
　　 5、對臨床和實驗研究中出現(xiàn)頻率最高的4味抗流感單味藥甘草、金銀花、黃芩和連翹進行了化學成分收集，構(gòu)建抗流感中藥化學成分數(shù)據(jù)庫(AICMD)，其中收錄620個化合物。對AICMD進行虛擬篩選，得分排名前25位的化合物中，有12個來自甘草，10個來自連翹，2個來自黃芩，1個來自金銀花，化合物的結(jié)構(gòu)類型包

13、含黃酮類、酚類和苯丙素類等。所有化合物都與NA中的S1區(qū)形成氫鍵或靜電作用，其中與S1區(qū)相互作用的結(jié)構(gòu)片段包括羧基、黃酮類母核和苯酚結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論:
　　 1、本研究表明GOLD和Surflex-Dock對09N1體系的分子對接均具有一定可靠性，在GOLD對接中，宜選擇GoldScore作為打分函數(shù)，這可為以后09N1體系的分子對接研究提供參考。構(gòu)建了4個09NAI的藥效團模型，其中模型1～3可用于09N1或經(jīng)典N1

14、抑制劑的虛擬篩選。基于藥效團搜索、類藥性評價和分子對接技術(shù)，采用兩種篩選方法，從TCMD中篩得了結(jié)構(gòu)類型互補的潛在NAI，提高了篩選效率，這對大型數(shù)據(jù)庫的虛擬篩選具有啟發(fā)意義。
　　 2、所構(gòu)建的抗流感中藥化學成分數(shù)據(jù)庫(AICMD)不同于以往數(shù)據(jù)庫，主要用于抗流感有效成分的篩選，一方面為基于CADD的抗流感藥物設(shè)計提供便利，另一方面有助于加快抗流感中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究，具有原創(chuàng)性和實用價值。
　　 3、從TCM

15、D和AICMD中篩得的黃酮類、多酚類和含羧基化合物等具有上市藥物或天然產(chǎn)物NAI的結(jié)構(gòu)特征，都是有潛力的NAI。其中牡荊素、(-)-表兒茶精-3-O-沒食子酸酯、黃芩苷、木犀草素和木犀草苷具有NA抑制活性，本研究揭示了它們與NA的作用模式。黃酮類化合物F2和木脂素PP3具有抗流感病毒作用，本研究推測它們通過抑制NA來發(fā)揮抗流感作用。從甘草中篩得許多含異戊二烯基的黃酮類化合物，它們是潛在的抗耐藥性NAI。
　　 4、從TCMD中篩

16、得的硫苷類化合物得分遠高于ZMR，從連翹中篩得的2個木脂素PP1和PP2具有類似于ZMR的作用模式，它們都是有潛力的新型NAI。本研究結(jié)果將為后續(xù)的藥理活性實驗提供新思路，并為探索抗流感中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供線索。
　　 5、分子對接結(jié)果顯示，本研究收集的所有天然產(chǎn)物09NAI和從TCMD和AICMD中篩得的化合物都與NA活性位點S1區(qū)形成氫鍵或靜電作用，這為NAI設(shè)計提供了重要啟示。本研究總結(jié)出6種能與S1區(qū)產(chǎn)生作用的結(jié)

17、構(gòu)片段，即5-羥基色原酮、2-羥基苯乙酮、苯基脂肪酮(苯基與羰基間碳原子數(shù)為1～3)、鄰苯二酚類、1，3-丙二酮和硫酸酯基等結(jié)構(gòu)片段，將為NAI的結(jié)構(gòu)改造提供理論指導(dǎo)。
　　 6、不同于上市NAI，09N1抑制劑katsumadain A和從TCMD中篩得的生物堿AL2主要以范德華力和疏水作用力同NA結(jié)合，且都與NA中“245-環(huán)”和“430-環(huán)”及附近殘基形成較強疏水作用;基于10個天然產(chǎn)物09NAI構(gòu)建的藥效團模型中，有一個