天然產(chǎn)物中α-糖苷酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)體系研究.pdf

1、糖尿病是一類由胰島素分泌功能受損引起的，以持續(xù)的高血糖為主要生化特征的代謝綜合征?？刂蒲撬绞翘悄虿≈委熯^程中的關(guān)鍵要素。一種重要的策略是通過抑制淀粉水解延緩小腸中的淀粉消化及葡萄糖吸收過程來實(shí)現(xiàn)。腸道內(nèi)淀粉消化需要三種主要的α-糖苷酶參與，首先胰腺α-淀粉酶(HPA)將淀粉水解成短的直鏈或支鏈的寡糖，寡糖隨后被麥芽糖-葡萄糖苷酶(MGAM)和蔗糖-異麥芽糖酶(SI)水解為葡萄糖。其中，MGAM擁有兩個(gè)功能獨(dú)立的催化亞基（MGAM-N

2、和MGAM-C）。目前α-糖苷酶已經(jīng)逐漸成為降糖藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)之一。
　　天然產(chǎn)物是藥物開發(fā)的重要資源之一，許多有價(jià)值的酶抑制劑都來源于天然產(chǎn)物，而從天然產(chǎn)物中篩選α-糖苷酶抑制劑并進(jìn)行藥物開發(fā)已成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。本研究利用已構(gòu)建的包含411種傳統(tǒng)中藥的提取物庫，分別針對(duì)HPA，MGAM-N和MGAM-C三種靶蛋白，進(jìn)行α-糖苷酶抑制劑的篩選。發(fā)現(xiàn)23種中藥提取物對(duì)MGAM-N有明顯抑制效果;20種對(duì)MGAM-C有明顯抑制作

3、用;16種對(duì)HPA有明顯抑制活性。篩選結(jié)果顯示出一定的規(guī)律，對(duì)HPA有抑制作用的中藥與對(duì)MGAM-N/C有抑制活性的中藥有較為明顯的差異。
　　進(jìn)一步對(duì)1000株土壤放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行篩選，獲得20株α-糖苷酶抑制劑生產(chǎn)菌。應(yīng)用柱前衍生化高效液相色譜法對(duì)α-糖苷酶抑制劑1-脫氧野尻霉素(DNJ)產(chǎn)生菌進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一株編號(hào)為PW409的DNJ產(chǎn)生菌。通過對(duì)PW409菌株進(jìn)行多相分類學(xué)研究，將PW409菌株初步確定為戈壁三素鏈

4、霉菌(Streptomyces gobitrici)。在此基礎(chǔ)上開發(fā)了基于生物學(xué)活性的高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Q/TOF)α-糖苷酶抑制劑篩選方法，對(duì)鏈霉菌PW409的發(fā)酵液進(jìn)行活性物質(zhì)的分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產(chǎn)物中除含有DNJ以外，還含有α-糖苷酶抑制劑類米格列醇(miglitol)，其中DNJ在發(fā)酵液中的含量為11.2 mg/L，miglitol的含量為95.8 mg/L，為α-糖苷酶抑制劑的開發(fā)提供了新的菌種

5、資源。
　　本研究發(fā)現(xiàn)天藍(lán)黃鏈霉菌ZG656產(chǎn)生的混合型抑制劑AIB656具有極強(qiáng)的α-淀粉酶抑制活性，同時(shí)也對(duì)MGAM-N和MGAM-C有較強(qiáng)的抑制作用。本課題開發(fā)了基于多靶點(diǎn)的生物活性發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)方法對(duì)AIB656中的α-糖苷酶抑制劑進(jìn)行系統(tǒng)的篩選及鑒定。利用UPLC-Q/TOF從AIB656中共鑒定出51種阿卡他定類化合物，并發(fā)現(xiàn)5個(gè)餾分對(duì)MGAM-N有明顯的抑制活性;8個(gè)餾分對(duì)MGAM-C有顯著的抑制活性;9個(gè)餾分對(duì)HPA有

6、較強(qiáng)的抑制活性。生物活性篩選結(jié)合虛擬的分子對(duì)接篩選的研究結(jié)果顯示:分子量較小的阿卡他定分子(2-4個(gè)類糖環(huán))顯示出較強(qiáng)的MGAM-N抑制活性。3-5個(gè)類糖環(huán)的分子對(duì)MGAM-C有較強(qiáng)的抑制活性;分子量較大的阿卡他定分子（6-15個(gè)類糖環(huán)）具有明顯的HPA抑制活性。結(jié)果表明三種α-糖苷酶對(duì)不同分子大小的阿卡他定類抑制劑的選擇性有較大的差異。通過分子對(duì)接計(jì)算及相互作用研究，推測(cè)阿卡他定I0-1分子是通過與氨基酸Asp327，Asp542，H

7、is600和Asp203形成氫鍵，而牢固地結(jié)合于MGAM-N的活性中心，并完全占據(jù)MGAM-N活性中心的兩個(gè)D-葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)（-1和+1位），阿卡他定I0-1分子中N-鍵取代了MGAM-N正常底物中的O-連糖苷鍵導(dǎo)致其抑制活性的產(chǎn)生。阿卡他定I01完全占據(jù)MGAM-C活性中心的結(jié)合位點(diǎn)（-1，+1，+2和+3位），從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度解釋了I0-1是阿卡他定類分子中最強(qiáng)的MGAM-N的抑制劑和I01是阿卡他定類分子中最強(qiáng)的MGAM-C的抑

8、制劑的分子機(jī)制。
　　而DNJ為代表的α-糖苷酶抑制劑的生物利用度研究表明，α-糖苷酶抑制劑在體內(nèi)的吸收速度較快，DNJ的達(dá)峰時(shí)間為0.8 h，絕對(duì)生物利用度達(dá)到55.02％。考慮到DNJ被快速吸收入血會(huì)減弱DNJ抑制小腸內(nèi)α-糖苷酶的作用，本論文通過考察添加不同的藥用輔料來改變DNJ在體內(nèi)的吸收特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):加入0.5％羧甲基纖維素鈉(CMCNa)能夠顯著降低DNJ的最大血藥濃度，降低DNJ在大鼠體內(nèi)的血藥曲線下面積，表明CM

9、CNa能夠抑制和延緩DNJ在腸道內(nèi)的吸收。小鼠的口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)也證明了CMCNa能夠增強(qiáng)DNJ的降糖效果。
　　本研究分別建立了液相、質(zhì)譜、分子對(duì)接與酶學(xué)檢測(cè)相結(jié)合的多種α-糖苷酶抑制劑的篩選策略，并針對(duì)MGAM-N，MGAM-C和HPA，對(duì)中藥提取物以及放線菌次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了的系統(tǒng)的篩選，結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析使我們明確了不同的α-糖苷酶對(duì)抑制劑分子的選擇偏好存在明顯的差異，而多個(gè)不同大小的α-糖苷酶抑制劑分子的聯(lián)合使用會(huì)對(duì)糖