大鼠急性心肌梗死后c-kit+心臟干細(xì)胞增殖分化的時(shí)序觀察.pdf

1、研究背景:
　　隨著近年來(lái)我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，老齡化的提高、飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，冠心病的發(fā)病率不斷增高，雖然目前治療手段取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，然而這些治療均不能挽救已經(jīng)梗死的心肌，從而導(dǎo)致了急性心肌梗死后慢性心功能不全發(fā)生率的上升。而長(zhǎng)期以來(lái)人們認(rèn)為心臟是一個(gè)分化終末的器官，而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)心臟存在能夠增殖分化干細(xì)胞，這使得修復(fù)損傷心肌成為可能，而這類(lèi)細(xì)胞中以c-kit+心臟干細(xì)胞的修復(fù)能力最強(qiáng)。明確在自然病程狀態(tài)下，急性心肌梗死后

2、c-kit+心臟干細(xì)胞的增殖和分化狀態(tài)對(duì)我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)心臟干細(xì)胞、利用干細(xì)胞開(kāi)展治療有很大幫然，然而至今極少研究涉及這一問(wèn)題。因此本課題選擇在無(wú)任何干預(yù)狀態(tài)下觀察心臟c-kit+陽(yáng)性心臟干細(xì)胞增生和分化的時(shí)序變化。
　　研究目的:
　　本研究采用開(kāi)胸冠脈結(jié)扎法制備大鼠心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，利用組織學(xué)和免疫熒光技術(shù)研究急性心肌梗死后的病理改變，c-kit+陽(yáng)性心臟干細(xì)胞增殖狀態(tài)、數(shù)量、和位置隨時(shí)間改變的情況，以及這類(lèi)細(xì)胞的最終分化

3、方向。
　　研究方法:
　　選取SD大鼠25只，雌雄不限，有復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重170±10g。將動(dòng)物隨分配到5個(gè)組（每組各5只）:分別為對(duì)照組（假手術(shù)組）、急性心肌梗死后1天組、急性心肌梗死后3天組、急性心肌梗死后7天組及急性心肌梗死后28天組。以開(kāi)胸結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支的方法制備大鼠急性心肌梗死模型，對(duì)照組僅開(kāi)胸置縫線，不結(jié)扎，術(shù)后連續(xù)腹腔注射青霉素3天。用肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖評(píng)估造模成功與否。造模成功后

4、，分別于術(shù)后1天、3天、7天及28天，以過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，開(kāi)胸取心臟，切下梗死心肌后于甲醛溶液中侵泡72小時(shí)，后制成石蠟切片，分別進(jìn)行HE染色、Masson染色、c-kit免疫熒光染色、ki-67免疫熒光染色、GATA4免疫熒光染色，Nkx2.5免疫熒光染色。免疫熒光染色時(shí)以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。用光學(xué)纖維鏡觀察HE染色、Massoon染色切片，已明確急性心肌梗死后心臟組織學(xué)改變，熒光顯微鏡觀察免疫熒光片和并采集圖片，以觀察心

5、臟c-kit心臟干細(xì)胞數(shù)量、位置及增值狀態(tài)隨時(shí)間變化的變化。
　　研究結(jié)果:
　　(1)開(kāi)胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支后，左室前壁蒼白，左心耳充血，心室收縮活動(dòng)減弱，心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)ST段抬高，顯示模型制備成功。
　　(2)HE及Masson染色顯示梗死區(qū)位于左室前壁及室間隔前部，梗死部位核消失、肌纖維排列紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，后期纖維結(jié)締組織增生，替代壞死心肌組織，新生毛細(xì)血管形成。驗(yàn)證了經(jīng)典急性缺血后的心肌病例變化。

6、　　(3)以免疫熒光顯微鏡觀察熒光染色切片，結(jié)果提示在壞死相關(guān)區(qū)域，c-kit陽(yáng)性表達(dá)在心肌梗死1天未見(jiàn)較對(duì)照組的明顯差異，3天后較對(duì)照組顯著上升，7天時(shí)達(dá)到高峰，28天后較對(duì)照組無(wú)明顯差異,c-kit主要表達(dá)于缺血壞死相關(guān)區(qū)域，在未受缺血損傷心肌較對(duì)照組無(wú)明顯差異。Ki-67的表達(dá)與c-kit相吻合，在心肌梗死1天未見(jiàn)較對(duì)照組的明顯差異，3天后較對(duì)照組顯著上升，7天時(shí)達(dá)到高峰，28天后較對(duì)照組無(wú)明顯差異，但其表達(dá)呈現(xiàn)全心增多，不僅限制

7、于缺血梗死相關(guān)區(qū)域。GATA4及Nkx2.5的在梗死后早期表達(dá)升高，位于核內(nèi)，梗死晚期其表達(dá)下降，主要位于核周。
　　結(jié)論:
　　1、本研究通過(guò)開(kāi)胸冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法成功制作了大鼠急性心肌梗死模型，驗(yàn)證心梗后心臟組織學(xué)改變，這一過(guò)程以心肌細(xì)胞大量壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肉芽組織增生壞死部位纖維化為突出特征，最終導(dǎo)致梗死部位心肌厚度下降，瘢痕形成，收縮功能消失。
　　2、在無(wú)外界干預(yù)的大鼠急性心肌梗死模型中，早起缺血相關(guān)區(qū)域c-