SDF-1α體外促新生小鼠c-kit+心干細(xì)胞遷移和增殖.pdf

1、背景：
　　干細(xì)胞已經(jīng)運(yùn)用于心肌梗死的臨床與基礎(chǔ)方面的研究，近年來，心干細(xì)胞的研究和發(fā)現(xiàn)為心肌梗死治療開辟了一條展新的途徑。心肌損傷壞死后，不能迅速有效產(chǎn)生大量的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞快速增殖并分泌基質(zhì)形成纖維瘢痕，限制損傷心肌組織再生，妨礙心干細(xì)胞向損傷壞死區(qū)遷移。因此，如何快速原位激活心干細(xì)胞、促進(jìn)干細(xì)胞增殖、遷移和歸巢，探尋心肌梗死治療的分子靶點(diǎn)成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　目的：
　　探討基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(S

2、tromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)體外促進(jìn)c-kit+心干細(xì)胞遷移和增殖作用。
　　材料和方法：
　　從GenBank上檢索SDF-1α基因序列，設(shè)計(jì)引物序列和病毒構(gòu)建方案，交由生物公司構(gòu)建含SDF-1α目的基因慢病毒(LV-SDF-1α)。
　　酶消化法培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞，不同濃度LV-SDF-1α轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞，檢測最佳轉(zhuǎn)染MOI值;Dot-blot法檢測轉(zhuǎn)染LV-SDF

3、-1α的心肌成纖維細(xì)胞在不同時(shí)間培養(yǎng)上清液中SDF-1α的表達(dá)，以轉(zhuǎn)染空載體病毒(CON145)的心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清為對照組。
　　利用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代心組織細(xì)胞，培養(yǎng)至第20天，流式細(xì)胞儀分選得到純化的c-kit+心干細(xì)胞;繼續(xù)培養(yǎng)，鏡下觀察c-kit+心干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;使用免疫熒光雙標(biāo)法技術(shù)，檢測心肌早期標(biāo)志物Nkx2.5和心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志cTnT(Cardiactroponin T)的表達(dá)。
　　利用Tra

4、nswell小室共培養(yǎng)轉(zhuǎn)染慢病毒的心肌成纖維細(xì)胞與流式分選得來的c-kit+心干細(xì)胞，并利用AMD1000阻斷劑，研究SDF-1α促c-kit+心干細(xì)胞的遷移;酶聯(lián)免疫分析試劑盒定量檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組SDF-1α的表達(dá)量。
　　利用Click-iT(R)EdU細(xì)胞增殖分析試劑盒檢測c-kit+心干細(xì)胞的增殖。
　　計(jì)量資料以(x)±s表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD

5、分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　心肌成纖維轉(zhuǎn)染LV-SDF-1α，1×107和1×108劑量病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞均呈GFP綠色熒光表達(dá)， Dot-blot法示培養(yǎng)上清液中SDF-1α在轉(zhuǎn)染后第4天時(shí)表達(dá)最高。
　　組織塊法培養(yǎng)的心肌組織細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選可得到高純度的c-kit心干細(xì)胞，分選陽性率在40％左右，繼續(xù)培養(yǎng)20天左右可見其形態(tài)由小圓亮細(xì)胞變化為長梭形或不規(guī)則橢圓形，免疫熒光顯示cTnT均

6、呈陽性表達(dá)。
　　C-kit+心干細(xì)胞與轉(zhuǎn)染LV-SDF-1α的心肌成纖維細(xì)胞Transwell技術(shù)共培養(yǎng)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)上清液中SDF-1α表達(dá)量與對照組間比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); c-kit+心干細(xì)胞的遷移數(shù)量與轉(zhuǎn)染CON145和AMD3100對照組相比明顯增多，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　EdU示蹤顯示，SDF-1α不能有效地促進(jìn)c-kit+心干細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論：
　　轉(zhuǎn)染病毒