2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、目的:血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)能夠促進(jìn)內(nèi)源性心臟干細(xì)胞(cardiac stem cells,CSCs)向心肌樣細(xì)胞分化。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor-associated factor6,TRAF6)是一個(gè)泛素連接酶,能夠促進(jìn)P38和JNK介導(dǎo)的非Smad依賴性TGF-β信號(hào)通路的激活。然而,其具體的激活機(jī)制尚不清楚。本研究擬探討TGF-β/TRAF6是否在c-kit+CSCs分化過程發(fā)揮作用

2、,并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行初步探索。
  方法:通過植塊培養(yǎng)和流式分選從新生SD大鼠的心肌組織內(nèi)分離出c-kit陽性的心臟干細(xì)胞群,通過細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。TGF-βⅠ受體抑制劑(SB431542)用來抑制SMAD2/3蛋白的磷酸化,靶向性敲除TRAF6的小干擾RNA(siRNA)用以研究TGF-β信號(hào)通路中TRAF6的功能,作用于靶標(biāo)基因3′-UTR區(qū)的TRAF6 siRNA“救援實(shí)驗(yàn)”能夠避免siRNA的脫靶現(xiàn)象。構(gòu)建TRAF

3、6顯性負(fù)性突變體(TRAF6 dominant-negative,TRAF6-DN)并轉(zhuǎn)染傳代c-kit+CSCs。腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染用來過表達(dá)或沉默TRAF6,用TRAF6-siRNA或Ad-TRAF6處理細(xì)胞后,檢測(cè)心肌特異性蛋白和Wnt信號(hào)通路蛋白;免疫共沉淀檢測(cè)TRAF6和TGF-β受體的相互作用、TRAF6的泛素化水平;Western免疫印跡法檢測(cè)Wnt3a、Wnt5a、Cx-43和cTnT蛋白水平的表達(dá)變化。
  結(jié)果:

4、流式分選出的c-kit+CSCs未檢測(cè)到CD34+、CD45+和CD133+的陽性表達(dá)。AngⅡ呈時(shí)間依賴性的促進(jìn)c-kit+CSCs內(nèi)P38和JNK的磷酸化,并且這一作用不能被SB431542所抑制。TRAF6-siRNA干擾c-kit+CSCs中AngⅡ介導(dǎo)的P38和JNK磷酸化激活?!熬仍畬?shí)驗(yàn)”中重組的TRAF6 cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入TRAF6沉默的c-kit+CSCs后,能夠恢復(fù)AngⅡ?qū)AK1、JNK和P38的磷酸化激活作用。An

5、gⅡ處理c-kit+CSCs30分鐘后,進(jìn)行泛素蛋白免疫共沉淀,可以觀察到TRAF6多聚泛素化程度顯著增加。TRAF6沉默增加Wnt3a蛋白表達(dá),而TRAF6過表達(dá)降低 Wnt3a蛋白表達(dá),促進(jìn)AngⅡ介導(dǎo)的心肌特異性蛋白cTnT和Cx-43表達(dá)增加。
  結(jié)論:TRAF6能夠介導(dǎo)AngⅡ激活的非經(jīng)典TGF-β信號(hào)通路參與c-kit+CSCs的分化進(jìn)程,機(jī)制可能是通過TRAF6的Lys63多聚泛素化和對(duì)下游TAK1、P38和JNK

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