結(jié)核分枝桿菌抗原特異性體液免疫應(yīng)答的篩查及其臨床意義初探.pdf

1、結(jié)核?。╰uberculosis，TB）主要是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tb）感染引起的傳染性疾病，病原菌主要通過空氣經(jīng)呼吸道傳播。結(jié)核病是目前僅次于AIDS的第二大傳染病殺手，2012年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示全球新發(fā)結(jié)核病患者達(dá)870萬之多，死于結(jié)核病人數(shù)達(dá)140萬；中國是全世界結(jié)核病高負(fù)擔(dān)的國家之一，2011年新增結(jié)核病人數(shù)達(dá)90~110萬，僅次于印度位居世界第二[1]。因此，結(jié)核病的國內(nèi)

2、外防控形勢非常嚴(yán)峻。
　　為更有效地控制結(jié)核病的傳播以及降低其發(fā)病率和致死率,我們不僅需要具有免疫保護(hù)作用的疫苗，及時準(zhǔn)確的診斷技術(shù)和優(yōu)化的治療方案也是結(jié)核病防控的重要環(huán)節(jié)。然而，目前上述三個方面都存在缺陷和發(fā)展瓶頸：BCG疫苗是目前唯一批準(zhǔn)使用的結(jié)核病預(yù)防性疫苗，其使用已經(jīng)超過一百年，雖然至今仍在使用，但其只對兒童起保護(hù)作用，而無法控制結(jié)核病在成年人之間的傳播，保護(hù)效果存在很大局限性；當(dāng)前結(jié)核病的治療藥物基本是在上世紀(jì)初發(fā)展起來

3、的抗菌藥物，特異性差，治療時間長，且副作用大，并隨著耐藥結(jié)核的出現(xiàn)，藥物治療效果日益受到挑戰(zhàn)；結(jié)核病是目前臨床上診斷最為復(fù)雜的疾病之一,現(xiàn)有臨床診斷技術(shù)在準(zhǔn)確性和及時性上仍顯不足，痰涂片抗酸染色法(sputum smear microscopy)只有在患者痰液中 M.tb含量很高的時候才能檢測為陽性，因此很容易出現(xiàn)假陰性；痰結(jié)核菌培養(yǎng)法（sputum culture test）能提供更高的準(zhǔn)確性，但此法周期長（三周至兩個月），可能延誤治

4、療；基于遲發(fā)型超敏反應(yīng)的PPD皮試試驗(yàn)則由于受檢者接種過BCG而出現(xiàn)假陽性，也很難區(qū)分潛伏感染和活動期結(jié)核病。因此，結(jié)核病在預(yù)防、診斷和治療方面都需得到進(jìn)一步提高。
　　抗M.tb感染免疫應(yīng)答中，細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮關(guān)鍵作用，而體液免疫應(yīng)答的作用則存在爭議。然而越來越多的證據(jù)表明，體液免疫應(yīng)答在抗M.tb感染中具有重要作用。探討M.tb感染引起的抗原特異性體液免疫應(yīng)答格局不僅能為體液免疫應(yīng)答在抗 M.tb感染中的作用提供證據(jù)，還將為新

5、疫苗的開發(fā)、新型診斷標(biāo)志物的篩選以及生物免疫治療方案等研究提供新的候選分子。
　　本研究中，我們利用生物信息學(xué)分析等方法，篩選和獲得多個膜型或是分泌型結(jié)核分枝桿菌病原蛋白，通過原核系統(tǒng)表達(dá)并純化其中39個M.tb蛋白質(zhì)抗原，通過間接ELISA試驗(yàn)比較檢測了活動期結(jié)核病患者與健康人群對照組血漿中抗原特異性IgG、IgM和IgA的水平。39個抗原特異性IgG水平的檢測結(jié)果顯示，活動期結(jié)核病患者體內(nèi)的抗原特異性 IgG水平普遍高于健康對

6、照組，其中28個抗原的IgG水平升高存在顯著性差異；對22個抗原特異性IgA水平檢測結(jié)果顯示，其中20個抗原特異性IgA水平在活動期結(jié)核病患者與健康對照組相比，存在顯著性升高；對10個抗原的特異性IgM水平檢測結(jié)果顯示，活動期結(jié)核病患者的抗原特異性IgM水平普遍則低于健康對照組，其中7個抗原的IgM水平在患者中減低具有顯著性差異。上述結(jié)果表明，活動期結(jié)核病患者中代表初次免疫應(yīng)答的病原菌抗原特異性IgM水平明顯低于正常對照，而再次應(yīng)答產(chǎn)生

7、的特異性IgG和IgA的水平在兩組人群中比例則表現(xiàn)為患者高于正常人，由此反映出活動期結(jié)核病患者中產(chǎn)生的結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答和再次免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)，這可能與這些活動期患者的結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染密切相關(guān)。對存在顯著性差異的結(jié)核分枝桿菌抗原特異性的IgG和IgA水平進(jìn)行ROC分析，結(jié)果顯示Rv0440（HSP65）和Rv3841的IgG檢測靈敏度達(dá)90％，特異性達(dá)90%，ROC曲線的AUC值分別達(dá)0.965和0.966，上述指標(biāo)均與目前臨

8、床上使用的抗38KD（Rv0934）蛋白的IgG水平相當(dāng)；部分抗38KD IgG抗體陰性的結(jié)核病患者中抗HSP65 IgG抗體水平呈現(xiàn)陽性，提示抗HSP65 IgG可以成為目前商業(yè)化抗38KDIgG檢測的補(bǔ)充，從而進(jìn)一步提高結(jié)核病診斷的靈敏度。
　　我們進(jìn)一步結(jié)合活動期結(jié)核病患者的臨床資料初步分析了患者的體液免疫應(yīng)答與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，比較分析發(fā)現(xiàn)，空洞陽性患者抗Rv0440的IgG水平，抗Rv1837c、Rv1860、Rv0733

9、和 Rv3841的 IgA水平顯著高于空洞陰性患者；抗酸染色陽性患者抗 Rv2626c、Rv1980c、Rv3875和Rv3841的IgM水平顯著高于抗酸染色陰性患者。
　　我們同時還比較活動期結(jié)核病人對上述部分結(jié)合分枝桿菌抗原的體液免疫應(yīng)答與細(xì)胞免疫應(yīng)答間的相關(guān)性，從而為深入了解體液免疫應(yīng)答與細(xì)胞免疫協(xié)同參與抗 M.tb感染的作用方式。為此，我們利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得的特異性抗原刺激下的IFNγ-ELISPOT試驗(yàn)數(shù)據(jù)代表抗原特異性

10、T細(xì)胞免疫應(yīng)答，分析結(jié)核病患者對同一抗原的抗體水平和釋放IFNγ的T細(xì)胞頻率之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示特異性 IgG抗體水平與同一抗原刺激下的分泌 IFNγ的 T細(xì)胞頻率間呈負(fù)相關(guān)性、無相關(guān)性或正相關(guān)性的抗原分別占1/3左右，而大部分抗原的IgA水平與T細(xì)胞應(yīng)答水平則呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)性。由于IgA是黏膜局部免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體分子，并進(jìn)一步分布于外周，部分病原特異性IgA水平在患者外周的顯著升高一方面提示與感染局部免疫應(yīng)答升高有關(guān)，其與外周