抗原85B特異性氨基酸序列質(zhì)譜檢測(cè)在鑒別診斷結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌感染中的價(jià)值.pdf

1、目的:目前全球范圍內(nèi)非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)的感染持續(xù)增多，而NTM與結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，Mtb)的治療方案及療程差別很大，因此有必要將Mtb與NTM區(qū)分開(kāi)。然而，由于Mtb與NTM的臨床及肺部影像學(xué)、痰涂片表現(xiàn)相似，且痰培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，因此，早期快速區(qū)分二者非常困難。許多新的NTM檢測(cè)技術(shù)越來(lái)越多的被研究，如:基于核酸擴(kuò)增的DNA檢測(cè)技

2、術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等血清學(xué)診斷方法等，但這些方法用于NTM的鑒定仍處于初級(jí)階段。
　　抗原85(Antigen85，Ag)復(fù)合物(Ag85A，Ag85B，Ag85C)是主要的結(jié)核分枝桿菌分泌抗原，分子量30-32KD，作為分枝?；D(zhuǎn)移酶在細(xì)胞壁合成中起到了重要作用。Ag85B首先在Mtb中鑒定，但在多種NTM中表達(dá)。通過(guò)酶免疫分析方法，結(jié)核Ag85B蛋白抗原或抗體已在血清、痰、腦脊液中被檢測(cè)到，由于各分枝桿菌的Ag85蛋白間具有

3、高度氨基酸序列同源性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能亦相似，通過(guò)傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法難以區(qū)分，尚未見(jiàn)Ag85B在應(yīng)用于診斷NTM的報(bào)道。
　　為了早期、準(zhǔn)確的鑒別NTM及Mtb感染，并判斷病情活動(dòng)性，我們進(jìn)行了本研究。在本實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)HPLC-MS/MS識(shí)別氨基酸序列，檢測(cè)Mtb或NTM感染病人的痰分枝桿菌培養(yǎng)上清或血清中的菌種特異性Ag85B目標(biāo)肽段，從而研究其在臨床分枝桿菌感染鑒別診斷及判斷結(jié)核病活動(dòng)性中的價(jià)值及臨床意義。
　　研究方

4、法:1、分枝桿菌Ag85B蛋白序列同源性分析與MtbAg85B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品胰酶酶切分析，以選取菌種特異性目標(biāo)肽段
　　通過(guò)分枝桿菌Ag85B蛋白序列比對(duì)結(jié)合Mtb Ag85B蛋白的理論胰酶酶切，選擇可區(qū)分Mtb與NTM潛能的片段做為目標(biāo)肽段。繼之在Mtb Ag85B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品胰酶酶切液中，驗(yàn)證目標(biāo)肽段。
　　2、應(yīng)用液相色譜分析在分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)上清中驗(yàn)證菌種特異性Ag85B目標(biāo)肽段，并建立血清中Ag85B檢測(cè)方法學(xué)

5、>　　應(yīng)用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，除鹽純化富集胰酶消化的分枝桿菌培養(yǎng)上清中的肽，通過(guò)HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)依賴性獲取(DDA)模式，分析分枝桿菌培養(yǎng)液上清中Ag85B蛋白酶切片段組成。通過(guò)液相色譜儀平行反應(yīng)監(jiān)視(PRM)模式，掃描分枝桿菌培養(yǎng)液上清中菌種特異性Ag85B目標(biāo)肽段，以提高信號(hào)強(qiáng)度及檢測(cè)敏感性。最后通過(guò)模擬血清Mtb Ag85B標(biāo)準(zhǔn)抗原抗體結(jié)合、解離及Ag85B富集、酶切，建立液相色譜檢測(cè)血清Ag85B的方法學(xué)。
　　3、在

6、臨床Mtb與NTM病人痰或血清樣品中檢測(cè)菌種特異性Ag85B目標(biāo)肽段
　　采用HPLC-MS/MS分析PRM模式，在一次運(yùn)行中檢測(cè)如下臨床樣品中Mtb或NTM菌種特異性Ag85B目標(biāo)肽段:87例肺結(jié)核病人、34例肺鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌感染(MAC)病人、21例肺堪薩斯(M.kansasii)感染病人痰及血清標(biāo)本;38例結(jié)核性胸膜炎病人（無(wú)痰或痰結(jié)核菌培養(yǎng)陰性）、41例肺外結(jié)核病人、48例潛伏性結(jié)核感染病人血清及36例健康對(duì)照者的血清樣

7、品。肺分枝桿菌感染病人經(jīng)痰培養(yǎng)陽(yáng)性確證，研究對(duì)象未包括HIV陽(yáng)性及應(yīng)用免疫抑制劑者。液相色譜數(shù)據(jù)通過(guò)軟件在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中與相應(yīng)蛋白及肽序列匹配，以確證鑒定菌種特異性Ag85B肽段，進(jìn)而診斷Mtb及NTM感染。
　　結(jié)果:1、可鑒別Mtb及NTM的分枝桿菌Ag85B蛋白目標(biāo)肽段的選擇
　　12種在UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中被預(yù)測(cè)可能分泌Ag85B的分枝桿菌菌株的Ag85B氨基酸序列全長(zhǎng)比對(duì)，提示了高同源性。與MtbAg85B蛋白

8、序列比較，常見(jiàn)感染的NTM如MAC及M.kansasiiAg85B蛋白展現(xiàn)了同Mtb較高的、超過(guò)80％的氨基酸序列同源性。Mtb Ag85B蛋白的理論胰酶酶切發(fā)現(xiàn)，肽NDPTQQIPK(m/z520.77，2+)顯示了可區(qū)分Mtb與NTM的潛力，并在Mtb Ag85B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的胰酶消化的多肽液中驗(yàn)證了該目標(biāo)肽段。
　　2、Ag85B菌種特異性氨基酸序列在Mtb及NTM菌株培養(yǎng)上清中的驗(yàn)證及Ag85B抗原抗體復(fù)合物解離試驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)

9、證
　　包括Mtb及常見(jiàn)NTM的14種分枝桿菌菌株的培養(yǎng)上清，液相色譜DDA模式分析表明，肽m/z520.77及其Ag85B同源性序列在Mtb，MAC，M.kansasii及M.scrofulaceum的菌株分泌蛋白中被檢測(cè)到。在上述標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)上清中液相質(zhì)譜PRM模式掃描結(jié)果，進(jìn)一步檢證了上述Ag85B菌種特異性目標(biāo)肽段序列，且肽信號(hào)強(qiáng)度顯著增加。在體外模擬Mtb Ag85B抗原抗體復(fù)合物結(jié)合并摻入非結(jié)核病人血清，按照上述方法學(xué)

10、應(yīng)用液相色譜可檢測(cè)到Ag85B菌種特異性目標(biāo)片段。
　　3、在臨床病人痰或血清樣品中檢測(cè)Mtb或NTM
　　通過(guò)酶切后液相質(zhì)譜檢測(cè)的方法，在所有肺結(jié)核病人、肺MAC感染病人及肺M.kansasii感染的病人的痰結(jié)核菌培養(yǎng)液上清中檢測(cè)到了相應(yīng)的菌種特異性Ag85B目標(biāo)肽段，而在空白對(duì)照培養(yǎng)液中未檢測(cè)到Ag85B片段，敏感性及特異性均為100％。通過(guò)液相色譜檢測(cè)分枝桿菌Ag85B菌種特異性目標(biāo)肽段，在34例MAC感染病人血清中檢

11、測(cè)的敏感性為88.2％，在21例M.kansasii感染病人血清中診斷的敏感性90.5％，在36例健康者的血清中未檢測(cè)到任何分枝桿菌Ag85B目標(biāo)片段，特異性為100％。在87例肺結(jié)核病人血清中檢測(cè)的敏感性為93.1％，在38例結(jié)核性胸膜炎及41例肺外結(jié)核的病人中，診斷的敏感性分別為92.1％及92.7％，在48例潛伏性感染結(jié)核者中沒(méi)有檢測(cè)到Mtb目標(biāo)Ag85B肽段，因此液相色譜檢測(cè)活躍性結(jié)核感染（合計(jì)166例）敏感性為92.7％，特異

12、性為100％。
　　結(jié)論:1、分枝桿菌Ag85B氨基酸序列的同源性較高，同Mtb相比，常見(jiàn)感染的NTM如MAC及M.kansasii Ag85B蛋白氨基酸序列同源性超過(guò)80％。蛋白序列比對(duì)提示肽NDPTQQIPK(m/z520.77，2+)及其同源性序列可做為液相質(zhì)譜目標(biāo)片段鑒別Mtb與NTM。
　　2、在Mtb，MAC與M.kansasii的標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)上清中，可通過(guò)液相質(zhì)譜掃描驗(yàn)證相應(yīng)目標(biāo)Ag85B菌種特異性肽段，從而鑒