臨床痰標(biāo)本中L型細(xì)菌的篩查及結(jié)核分枝桿菌利福平依賴變異研究.pdf

1、第一部分：臨床痰標(biāo)本中篩查結(jié)核分枝桿菌L型菌株
　　 目的：從就診于甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院的痰標(biāo)本中篩查結(jié)核分枝桿菌L型菌的存在情況；初步研究臨床標(biāo)本中L型結(jié)核分枝桿菌形態(tài)學(xué)變異。
　　 方法：為了篩查L型結(jié)核分枝桿菌，我們將2008年9月至2009年9月于蘭州市肺科醫(yī)院就診的340例痰培養(yǎng)標(biāo)本分別接種于羅氏培養(yǎng)基、MiddlebrookMGIT-960液體培養(yǎng)基、92-3TB含和不含氯化鈉液體培養(yǎng)基以及Middlebro

2、ok7H9含和不含蔗糖的半固體培養(yǎng)基中，觀察其菌落生長狀況。
　　 采用萋爾-納爾遜(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法將L型細(xì)菌培養(yǎng)基生長的菌落進(jìn)行涂片、染色、油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)。抽提菌株DNA，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因序列，進(jìn)行菌株的初步鑒定。由于牛分枝桿菌缺失RD7區(qū)(RV1970F)，結(jié)核分枝桿菌不存在RD7缺失，通過擴(kuò)增RD7區(qū)(RV1970F)片段進(jìn)行牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的區(qū)分。
　　 結(jié)果：

3、痰標(biāo)本編號為1415標(biāo)本，在含蔗糖的7H9(7H9-L)半固體培養(yǎng)基上可見煎蛋樣嵌入性生長，涂片抗酸染色可見抗酸染色陰性桿狀菌。PCR擴(kuò)增16SrRNA基因序列分析該菌屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。PCR擴(kuò)增該菌RD7片段顯示，該菌為結(jié)核分枝桿菌。感染該菌的患者為男性，19歲，有一年半的結(jié)核病史。
　　 結(jié)論：用7H9高滲半固體培養(yǎng)基可以從臨床痰標(biāo)本中分離出結(jié)核分枝桿菌L型菌株。該患者的肺部感染可能與L型的結(jié)核分枝桿菌有關(guān)。
　

4、　 第二部分：支氣管戈登菌L型菌株所致肺部感染
　　 目的：從就診于蘭州市肺科醫(yī)院的痰標(biāo)本中篩查L型細(xì)菌，并進(jìn)行L型細(xì)菌鑒定、表型變異及致病性研究。
　　 方法：我們將2008年9月至2009年9月于蘭州市肺科醫(yī)院就診的340例痰培養(yǎng)標(biāo)本分別接種于羅氏培養(yǎng)基、Middlebrook MGIT-960液體培養(yǎng)基、92-3TB含和不含氯化鈉液體培養(yǎng)基以及Middlebrook7H9含和不含蔗糖的半固體培養(yǎng)基中，觀察其菌落生

5、長狀況。將培養(yǎng)L型細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性的菌落做革蘭氏(Gram)染色和ZN抗酸染色法；并傳代培養(yǎng)，觀察菌株的形態(tài)，是否存在返祖現(xiàn)象；同時做掃描電鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)。提取分枝桿菌DNA，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因序列進(jìn)行菌種鑒定。
　　 結(jié)果：痰標(biāo)本編號為866和1302，在含蔗糖的7H9(7H9-L)半固體培養(yǎng)基上呈煎蛋樣嵌入性生長，在含氯化鈉的92-3TB液體培養(yǎng)基也生長。866和1302菌株涂片抗酸染色鏡下觀察可見大小不等的

6、抗酸陰性球形菌。傳代培養(yǎng)兩代后可見橘紅色菌落，涂片抗酸染色可見少量抗酸染色陽性桿狀菌，電鏡觀察見菌體為桿狀。PCR擴(kuò)增16SrRNA DNA，經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)該菌株為放線菌目戈登氏菌屬的支氣管戈登菌(Gordonia bronchialis,G.bronchialis)。該支氣管戈登菌屬對利福平和利福噴丁敏感，而對異煙肼、吡嗪酰胺、對氨基水楊酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺以及鏈霉素均耐藥。痰標(biāo)本編號866的患者，男性，78歲，間斷性咳嗽咯血

7、四年。痰標(biāo)本編號為1302患者為門診病人，男性，38歲。
　　 結(jié)論：L型支氣管戈登菌在臨床痰標(biāo)本中存在，可能與肺部感染有關(guān)。
　　 第三部分：臨床痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌利福平依賴表型變異研究
　　 研究目的：從就診于甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院的痰標(biāo)本中篩查利福平依賴結(jié)核分枝桿菌，初步研究利福平依賴結(jié)核分枝桿菌表型變異和rpoB突變研究。
　　 方法：甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院檢驗科培養(yǎng)的200例痰標(biāo)本，經(jīng)過消化液消化

8、，離心集菌，接種于Middlebrook MGIT960液體培養(yǎng)基、含與不含利福平的羅氏培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)，觀察菌落生長情況.如果菌株為利福平依賴株，接種于含與不含利福平的羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。Middlebrook MGIT960液體培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性菌株運用絕對濃度法做藥敏試驗。采用萋爾-納爾遜(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法對羅氏培養(yǎng)基有菌落生長的標(biāo)本進(jìn)行涂片、染色、油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)。提取分枝桿菌DNA，PCR擴(kuò)增長度為58

9、0 bp的16S rRNA DNA序列和rpoB基因高變區(qū)3519 bp，分別進(jìn)行基因?qū)W菌種鑒定以及rpoB基因序列的突變研究。
　　 結(jié)果：200例痰標(biāo)本中篩查到6例利福平依賴的菌株。6株利福平依賴菌株中男性3人(50％)，女性3人(50％)，平均年齡37.8歲(范圍25-55歲)。這六株利福平依賴菌株藥敏結(jié)果顯示耐利福平6例、耐SM的4例、耐INH的1例、耐PZA的4例以及耐TH的1例。抗酸染色顯示在不含有利福平的培養(yǎng)基中的