結(jié)核分枝桿菌38kDa抗原特異TCR基因修飾iNKT細(xì)胞及其活性研究.pdf

1、背景：
　　結(jié)核病(tuberculosis，TB)至今仍是威脅人類健康的主要傳染病。近年來(lái)，由于人口流動(dòng)性的增加、結(jié)核病控制措施的不完善以及耐藥和多重耐藥(MDR)結(jié)核菌株的產(chǎn)生和流行，導(dǎo)致結(jié)核病死灰復(fù)燃，成為感染率最高、病死率僅次于艾滋病的傳染病。當(dāng)前我國(guó)人口的結(jié)核感染率高達(dá)44.5％，估算全國(guó)活動(dòng)性肺結(jié)核病人500萬(wàn)，位居全球第二位。我國(guó)結(jié)核病的治療仍以化療為主，存在療程長(zhǎng)、毒副作用大等缺點(diǎn)，而且越來(lái)越多的結(jié)核病患者對(duì)抗生素

2、產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致結(jié)核病患者久治不愈。因此，亟需開創(chuàng)新的對(duì)耐藥患者和結(jié)核免疫缺陷患者有效的治療方法！
　　結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)屬胞內(nèi)寄生菌，體液免疫難以對(duì)其發(fā)揮作用。機(jī)體內(nèi)結(jié)核桿菌的清除需要固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的協(xié)調(diào)作用。iNKT細(xì)胞作為T細(xì)胞的亞群之一，不僅是天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁，而且是機(jī)體抗結(jié)核感染的第一道防線，在早期的抗結(jié)核免疫反應(yīng)中具有重要的保護(hù)作用。

3、結(jié)核病灶中的iNKT細(xì)胞被活化后，既能釋放γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等細(xì)胞因子，激活和趨化巨噬細(xì)胞，提高其抗原遞呈能力和對(duì)胞內(nèi)結(jié)核菌的殺滅;又能通過(guò)穿孔素和顆粒酶B(granzyme B，GrB)途徑直接殺傷感染的靶細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，清除胞內(nèi)寄生的結(jié)核菌。另外，iNKT細(xì)胞還參與結(jié)核肉芽腫的形成，有效地減少機(jī)體損傷，防止結(jié)核桿菌的

4、擴(kuò)散。
　　然而，研究發(fā)現(xiàn)感染結(jié)核的小鼠體內(nèi)iNKT細(xì)胞數(shù)量減少，且iNKT細(xì)胞失去免疫效力;在活動(dòng)性肺結(jié)核患者體內(nèi)亦發(fā)現(xiàn)iNKT細(xì)胞數(shù)量下降、功能被抑制。因此，在結(jié)核感染早期提高患者體內(nèi)iNKT細(xì)胞的數(shù)量和增強(qiáng)iNKT細(xì)胞的抗菌活性可能成為抑制結(jié)核桿菌生長(zhǎng)的有前景的治療策略。
　　作為T細(xì)胞的亞群，iNKT細(xì)胞同樣依賴其表面抗原受體(T cell receptor，TCR)識(shí)別抗原。人iNKT細(xì)胞表面的TCR恒定表達(dá)Vα2

5、4J18/Vβ11，識(shí)別抗原譜窄，僅能識(shí)別CD1d分子遞呈的糖脂質(zhì)抗原;由于結(jié)核桿菌表面并不含有CD1d分子識(shí)別的糖脂質(zhì)抗原，機(jī)體感染結(jié)核桿菌以后，iNKT細(xì)胞的活化需要依賴于巨噬細(xì)胞分泌的內(nèi)源性糖脂質(zhì)抗原iGb3。這些限制了iNKT細(xì)胞的抗結(jié)核活性。因此人為賦予iNKT細(xì)胞特異性的抗原識(shí)別能力，增加iNKT細(xì)胞的抗原識(shí)別譜，可以為iNKT細(xì)胞應(yīng)用于早期結(jié)核免疫治療開辟新的途徑。
　　目前，抗原特異的TCR基因修飾MHC限制性T細(xì)

6、胞和γδT細(xì)胞已得到證實(shí)。我們?cè)谇捌谝惨殉晒媒Y(jié)核抗原特異的TCR基因修飾T細(xì)胞，并獲得良好的抗結(jié)核活性。為增強(qiáng)iNKT細(xì)胞的抗結(jié)核活性并賦予其特異的殺傷能力，我們利用結(jié)核桿菌38 kDa抗原特異的CD8+T細(xì)胞的TCR基因修飾iNKT細(xì)胞，使其表達(dá)抗原特異的TCR，通過(guò)MHC-Ⅰ分子遞呈抗原發(fā)揮免疫效應(yīng)。
　　然而，TCR基因修飾同時(shí)仍存在一些問(wèn)題，通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法使本已表達(dá)TCR(Vα24J18/Vβ11)的iNKT細(xì)胞被

7、強(qiáng)制性配備額外的TCRα、β鏈，可能導(dǎo)致內(nèi)外源性TCRα、β錯(cuò)配。因此，細(xì)胞表面理論上將存在四種類型的TCR，即內(nèi)源性TCR、外源性TCR、內(nèi)源性β與外源性α錯(cuò)配產(chǎn)生的雜合TCR、內(nèi)源性α與外源性β錯(cuò)配產(chǎn)生的雜合TCR，因錯(cuò)配的TCR沒(méi)有經(jīng)過(guò)胸腺的陰性選擇，可能具有自身免疫性，且胸腺外尚未發(fā)現(xiàn)任何機(jī)制可以清除攜帶自身免疫TCR的T細(xì)胞，故內(nèi)、外源性TCR錯(cuò)配增加了自身免疫的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，四種類型的TCR將競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面恒定量的CD3分子及信

8、號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，稀釋了外源治療性TCR的作用。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，為使TCRα、β雙鏈均衡表達(dá)和避免內(nèi)、外源性TCR的錯(cuò)配，我們?cè)诓桓淖僒CR功能的前提下，利用2A多肽連接α、β雙鏈，利用鼠C區(qū)的九個(gè)氨基酸替換人TCR C區(qū)相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸。之后，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將改建后的結(jié)核38 kDa抗原特異的TCR轉(zhuǎn)染到iNKT細(xì)胞中，與未轉(zhuǎn)染的iNKT細(xì)胞比較，TCR基因修飾的iNKT細(xì)胞在體外能特異有效地對(duì)38 kDa抗原起作用，這些結(jié)果表

9、明，TCR基因修飾iNKT細(xì)胞被賦予了特異的識(shí)別和殺傷活性。
　　目的：
　　研究結(jié)核抗原38 kDa特異TCR基因修飾iNKT細(xì)胞體外抗結(jié)核活性，為開展結(jié)核特異TCR基因修飾iNKT細(xì)胞體內(nèi)抗結(jié)核作用研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他胞內(nèi)菌感染、腫瘤、病毒感染等疾病利用iNKT細(xì)胞進(jìn)行免疫治療提供平臺(tái)。
　　方法：
　　1.篩選結(jié)核抗原38 kDa特異TCR
　?、倭馨图?xì)胞分離液分離健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(p

10、eripheral bloodmononuclear cell，PBMC);②貼壁法獲取DC，IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)DC成熟;③磁珠分選出CD8+T細(xì)胞;④38 kDa抗原刺激DC三輪，誘導(dǎo)抗原特異CD8+T細(xì)胞發(fā)生克隆擴(kuò)增;⑤提取CD8+T細(xì)胞mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;⑥利用基因掃描(GeneScan)監(jiān)測(cè)刺激前后CDR3譜型變化，找出刺激后單克隆擴(kuò)增的抗原特異的CD8+T細(xì)胞TCR基因家族。
　　2.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載

11、體與包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒
　?、俑鶕?jù)GeneBank報(bào)道的人α、β基因家族可變區(qū)(variable region，V)和恒定區(qū)(constant region，C)基因序列，設(shè)計(jì)α、β鏈基因全長(zhǎng)序列引物，擴(kuò)增特異性TCRα、β全長(zhǎng)基因;②采用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的最小突變C區(qū)（其中9個(gè)氨基酸被鼠C區(qū)相位點(diǎn)的氨基酸替換）替換人α、β全長(zhǎng)基因的C區(qū);③利用重組PCR技術(shù)，將已最小突變TCRα、β基因通過(guò)自剪切多肽2A連接，并克隆至pGEM-T

12、載體測(cè)序鑒定。④將測(cè)序正確的α、β全長(zhǎng)基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP，酶切鑒定;⑤采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒，低溫差速離心法濃縮病毒;⑥重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定病毒感染NIH3T3細(xì)胞GFP的表達(dá)量，計(jì)算重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度。計(jì)算公式:病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3細(xì)胞總數(shù)×GFP陽(yáng)性率/病毒濃縮液量(ml)。
　　3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染iNKT細(xì)胞
　?、俨捎肍

13、icoll密度梯度離心法，分離健康志愿者外周血PBMC，IL-2和KRN7000擴(kuò)增iNKT細(xì)胞;②磁珠分選iNKT細(xì)胞;③重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染iNKT細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，確定最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI);④以最佳MOI將重組病毒轉(zhuǎn)染iNKT細(xì)胞;⑤利用PE熒光染料標(biāo)記的小鼠抗人TCR-Vβ5單抗，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)iNKT細(xì)胞表面結(jié)核特異TCR的表達(dá)。
　　4.TCR基因修飾iN

14、KT細(xì)胞活性測(cè)定
　　按不同效靶比（effector∶target，E∶T），將TCR基因修飾iNKT細(xì)胞與負(fù)載38 kDa的DC混合培養(yǎng)，以未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的iNKT細(xì)胞為陰性對(duì)照，以雞卵白蛋白（ovalbumin，OVA）和ESAT-6(early secreted antigenic target，6 kDa)為非特異性抗原對(duì)照;酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELI

15、SA)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)iNKT細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、 TNF-α、GrB的分泌水平，利用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time-resolved fluoroimmuno-assay，TRFIA）技術(shù)，檢測(cè)TCR基因修飾iNKT細(xì)胞對(duì)負(fù)載38 kDa抗原DC的殺傷活性。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較iNKT細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌水平以及殺傷

16、水平，方差不齊時(shí)用Welch校正，組間兩兩比較方差齊時(shí)用LSD法，方差不齊時(shí)用Dunnett'sT3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。采用SPSS17.0forwindows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：
　　1.分析刺激前后CDR3譜型，篩選抗原特異TCRCDR3譜型分析表明，結(jié)核分枝桿菌38 kDa抗原刺激前各TCR Vα(α chainvariable gene)、Vβ（β chain variable gen

17、e）基因家族的CDR3譜型均呈8個(gè)或多于8個(gè)峰型的高斯分布(Gaussian distribution)，表明各家族均為多克隆性。而38 kDa抗原刺激后，部分基因家族譜型發(fā)生改變，呈現(xiàn)偏態(tài)或者單峰分布，表明這些家族是由于38 kDa抗原持續(xù)刺激引起的寡克隆或單克隆增生。比較刺激前后CDR3譜型的變化，找出刺激前為多克隆，刺激后呈單克隆擴(kuò)增的Vα9、Vβ5基因家族。
　　2.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建以及重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染滴度的測(cè)定

18、
　　成功擴(kuò)增出經(jīng)最小突變的TCRα9、β5全長(zhǎng)基因，經(jīng)TA克隆后測(cè)序，TCRα9、β5基因V區(qū)DNA序列與GeneBank報(bào)道的V區(qū)序列完全一致，C區(qū)的基因序列與預(yù)期相符。利用自剪切多肽2A，通過(guò)重組PCR，擴(kuò)增出CD8+T細(xì)胞的hVβ5mCβ-2A-hVα9mCα融合基因，將其插入pMX-IRES-GFP，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pMX-hVβ5mCβ-2A-hVα9mCα-IRES-GFP，酶切鑒定證實(shí)基因片段插入正確。將

19、其與包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞GP2-293，48h后取病毒上清，濃縮純化后感染NIH3T3細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)、計(jì)算得重組病毒滴度分別為1.97×107IU/ml。
　　3.TCR基因修飾iNKT細(xì)胞
　　按不同的MOI，將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染iNKT細(xì)胞。MOI=8時(shí)，相差顯微鏡下觀察基因修飾的iNKT細(xì)胞高表達(dá)GFP。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，TCR基因修飾的iNKT細(xì)胞GFP的陽(yáng)性表達(dá)率為36.7％，外源性TC

20、R Vβ5的陽(yáng)性表達(dá)率為60.9％。。
　　4.TCR基因修飾iNKT細(xì)胞的抗結(jié)核抗原活性
　?、賂CR基因修飾iNKT細(xì)胞IFN-γ分泌水平
　　iNKT細(xì)胞IFN-γ分泌水平隨效靶比和共培養(yǎng)時(shí)間的變化而變化，在E∶T=7，共培養(yǎng)18h時(shí)TCR基因修飾iNKT細(xì)胞IFN-γ分泌水平達(dá)最高值。按E∶T=7，將TCR基因修飾iNKT細(xì)胞與負(fù)載抗原的DC的混合培養(yǎng)18h，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IFN-γ的分泌。結(jié)果顯示

21、，IFN-γ的分泌水平組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=814.923，P=0.000）。38 kDa抗原特異TCR基因修飾組IFN-γ分泌量(2225.954±53.655pg/ml)顯著高于其它各組，與各對(duì)照組相比有顯著性差異。
　　②TCR基因修飾iNKT細(xì)胞TNF-α分泌水平
　　iNKT細(xì)胞TNF-α分泌水平隨效靶比和共培養(yǎng)時(shí)間的變化而變化，在E∶T=20，共培養(yǎng)24h時(shí)TCR基因修飾iNKT細(xì)胞TNF-α分泌水平達(dá)最高

22、值。按E∶T=20，將TCR基因修飾iNKT細(xì)胞和負(fù)載38 kDa的DC混合培養(yǎng)24h，ELISA檢測(cè)上清中TNF-α的分泌。結(jié)果顯示，TNF-α的分泌水平組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1787.767，P=0.000）。38 kDa抗原特異TCR基因修飾組TNF-α分泌量(1299.701±13.183pg/ml)顯著高于其它各組，與各對(duì)照組相比有顯著性差異(P=0.000)。
　?、跿CR基因修飾iNKT細(xì)胞GrB分泌水平

23、>　　iNKT細(xì)胞GrB分泌水平隨效靶比和共培養(yǎng)時(shí)間的變化而變化，在E∶T=20，共培養(yǎng)24h時(shí)TCR基因修飾iNKT細(xì)胞GrB分泌水平達(dá)最高值。按E∶T=20，將TCR基因修飾iNKT細(xì)胞和負(fù)載38 kDa的DC混合培養(yǎng)24h，ELISA檢測(cè)上清中GrB的分泌。結(jié)果顯示，GrB的分泌水平組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21635.892，P=0.000）。38 kDa抗原特異TCR基因修飾組GrB分泌量(11.3643±0.031pg/m

24、l)顯著高于其它各組，與各對(duì)照組相比有顯著性差異(P=0.000)。
　?、躎CR基因修飾iNKT細(xì)胞的殺傷效應(yīng)
　　時(shí)間分辨免疫熒光法檢測(cè)TCR基因修飾iNKT細(xì)胞對(duì)負(fù)載38 kDa抗原DC的殺傷活性，結(jié)果顯示，38 kDa抗原特異TCR基因修飾組iNKT細(xì)胞殺傷水平隨E∶T的增大而升高，在E∶T=30，共培養(yǎng)4h時(shí)，38 kDa特異TCR基因修飾組iNKT細(xì)胞殺傷活性最高。按E∶T=30，將TCR基因修飾iNKT細(xì)胞和負(fù)

25、載38 kDa抗原的DC混合培養(yǎng)4h，時(shí)間分辨熒光免疫法分別檢測(cè)未轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、無(wú)關(guān)抗原組、相關(guān)抗原組、38 kDa抗原組iNKT細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果表明，各組間iNKT細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=87.375，P=0.000）。LSD多重比較結(jié)果提示，38 kDa抗原組iNKT細(xì)胞的殺傷活性最強(qiáng)，與各對(duì)照組相比有顯著性差異(P=0.000)。
　　結(jié)論：
　?、俦狙芯坷媒Y(jié)核分枝桿菌38 kD

26、a抗原體外刺激正常人外周血CD8+T細(xì)胞，獲得38 kDa抗原特異TCR，擬轉(zhuǎn)入iNKT細(xì)胞，人為賦予其特異性的抗原識(shí)別能力。由于轉(zhuǎn)入的TCRα、β鏈可能與內(nèi)源性TCR發(fā)生錯(cuò)配，為減少內(nèi)外源性TCRα/β鏈錯(cuò)配的機(jī)率，利用本實(shí)驗(yàn)室已成功設(shè)計(jì)出最小突變C區(qū)替換人TCRα/β鏈的C區(qū)。我們將TCR基因轉(zhuǎn)染自體iNKT細(xì)胞并檢測(cè)其活性，研究表明抗原特異TCR基因修飾的iNKT細(xì)胞在體外具有顯著的抗結(jié)核抗原活性。
　?、诒狙芯渴状巫C實(shí)了T