乳腺癌中miR-21、miR-125b動物成瘤實驗及其靶基因表達與患者術后生存率關系的研究.pdf

1、目的：MicroRNAs是一類長約20-24nt的單鏈非編碼RNA，在轉錄后水平負性調控靶基因的穩(wěn)定性和表達效率[1]。MicroRNAs的異常表達與腫瘤的發(fā)生密切相關[231，很可能是一類潛在的癌基因[4,5]或抑癌基因[6]。MiR-21被認定為是一種癌基因，參與腫瘤發(fā)生的多個進程[78,96,97,98,99]。近來的研究顯示miR-125b在多種腫瘤中充當抑癌基因的功能[88,89,90,91]。但miR-21及miR-125b

2、對于乳腺癌細胞株動物成瘤實驗研究還未見報道。本實驗利用裸鼠皮下成瘤實驗證明它們在乳腺癌細胞中的功能。MircoRNAs能通過調控靶基因影響腫瘤的生長[7]。本實驗根據(jù)已篩選出的miR-21及miR-125b靶基因進行研究，HBP1、eIF4A2、RSK1、ETV6這四個靶基因表達水平與患者預后的關系尚未見報道。我們應用免疫組織化學方法檢測miR-21及miR-125b預測靶基因的蛋白表達水平與乳腺癌患者預后的關系。另外，還應有用細胞體外

3、實驗方法進一步了解ETV6在乳腺癌中的功能。這些靶基因的研究為發(fā)現(xiàn)新的乳腺癌預后指標及進一步研究miRNA在乳腺癌發(fā)病機制中的作用打下基礎。
　　 方法：乳腺癌細胞株MCF-7分別轉染PNA-antimiR21及PNA-Control，MDA-MB-435細胞株分別轉染Pre-miRNA125b及Pre-Control，BALB/c雌性裸鼠皮下成瘤，觀察兩組間成瘤速度、腫瘤大小的差別。本實驗組已經(jīng)應用基因芯片和預測軟件得到miR

4、-21預測靶基因HBP1、eIF4A2、RAB6A、PACE4、PITX2及miR-125b預測靶基因ETS1、ETV6、RSK1、MNK2、UBE2E3、ASB13。搜集214例1999年至2004年中山大學腫瘤防治中心存檔的石蠟包埋浸潤性乳腺癌組織，制作成組織芯片，所有病例都有完整的臨床病理資料及5年以上的隨訪資料，術前均未接受放化療，病理診斷均為浸潤性乳腺癌。免疫組織化學EnVision二步法進行蛋白表達染色。Kaplan-Mei

5、er方法和Cox回歸分析統(tǒng)計蛋白表達水平與乳腺癌預后的關系。ROC曲線看靶基因對患者預后的預測效果。乳腺癌細胞株MCF-7、SK-BR-3分別轉染ETV6-siRNA和Control-siRNA后進行ETV6蛋白Weston-blotting檢測了解其轉染效果，轉染后進行細胞增殖、凋亡、克隆形成及細胞周期實驗，了解ETV6在乳腺癌細胞中的功能。
　　 結果：裸鼠成瘤實驗顯示Pre-miRNA125b及Pre-Control兩組間

6、腫瘤體積及瘤重有明顯差別(P＜0.05)，miR-125b具有明顯抑制MDA-MB-435細胞株皮下成瘤的能力；MCF-7組轉染PNA-antimiR-21后腫瘤體積、重量均比PNA-Control組的大，但統(tǒng)計學上無差異(P＞0.05)。Kaplan-Meier方法Log-Rank分析結果顯示miR-21預測靶基因HBP1、eIF4A2不同蛋白表達水平的術后5年生存率有顯著差別(P＜0.05)；miR-125b預測靶基因ETS1、ET

7、V6、RSK1不同蛋白表達水平的術后5年生存率有顯著差別(P＜0.05)。Cox多重回歸分析表明HBP1、 ETS1、ETV6及RSK1分別是乳腺癌獨立預后指標之一(P＜0.05)。ROC曲線結果提示相對與臨床常用的診斷指標，HBP1、ETS1、ETV6、RSK1對乳腺癌患者的預測效果更好。Weston-blotting檢測ETV6-siRNA和Control-siRNA轉染MCF-7、SK-BR-3細胞株成功，后進行增殖、凋亡、克隆形

8、成及細胞周期實驗，證明ETV6有促進細胞生長增殖和抑制凋亡的能力，但不是通過細胞周期調控其功能。
　　 結論：⑴裸鼠成瘤實驗顯示miR-125b能夠抑制乳腺癌細胞皮下成瘤能力，說明乳腺癌中miR-125b具有抑癌基因的功能。MiR-21在乳腺癌細胞裸鼠皮下成瘤實驗中的結果跟已有研究結果符合。⑵MiR-21預測靶基因的5年生存率的結果表明HBP1、eIF4A2可能作為乳腺癌預后的新指標。⑶MiR-125b預測靶基因的5年生存率結果