跨膜型TNF-α—白血病細(xì)胞的標(biāo)志物和抗體治療靶點Tim-3未知配體的尋找及其功能的初探.pdf

1、第一篇濾泡型淋巴瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞具有14/18號染色體易位的腫瘤特征
　　我們報道了一個病例,根據(jù)流式細(xì)胞儀及免疫熒光雜交技術(shù)檢測該病例淋巴結(jié),發(fā)現(xiàn)其含有50.26％惡性淋巴細(xì)胞和50％IGH/BCL-2陽性腫瘤細(xì)胞。為了確定腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞是否具有腫瘤的惡性特征,我們利用免疫磁珠法和CD31單克隆抗體從腫瘤組織中分離內(nèi)皮細(xì)胞,其形態(tài)學(xué)上呈扁長型的細(xì)胞形態(tài),胞漿中具有 Weibel-Palade小體;流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示,分離的內(nèi)皮細(xì)胞

2、高表達(dá) vWF和CD34,其純度超過90％。隨后,我們利用熒光原位雜交技術(shù)檢測純化的內(nèi)皮細(xì)胞染色體狀況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠色 IGH探針和紅色 BCL-2探針的單融合信號,與標(biāo)準(zhǔn)的濾泡型淋巴瘤14、18號染色體雙融合信號不同。這一獨特現(xiàn)象也在淋巴瘤細(xì)胞中觀察到。這可能因為 IGH位于的14號染色體斷裂點不同導(dǎo)致失去一個綠色融合信號。從腫瘤中分離的內(nèi)皮細(xì)胞,其染色體異常的比例達(dá)到18％,提示濾泡型淋巴瘤的一部分內(nèi)皮細(xì)胞具有與腫瘤細(xì)胞相同的染色體異

3、常等惡性特征。
　　第二篇跨膜型 TNF-α——白血病細(xì)胞的標(biāo)志物和抗體治療靶點
　　TNF-α對腫瘤有雙刃劍的作用:一方面 TNF-α能殺傷腫瘤細(xì)胞而無礙于正常細(xì)胞,另一方面 TNF-α也利于腫瘤生長,因為 TNFR基因敲除小鼠的腫瘤生長較野生型小鼠緩慢,腫瘤自身表達(dá) TNF-α,可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活,抵抗凋亡。本研究檢測跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)在白血病中的表達(dá),并初步探討 TM-TNF-α在白血病中的作用,觀

4、察 TM-TNF-α抗體體內(nèi)外對白血病細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。其主要結(jié)果如下:
　　1.TM-TNF-α在急性白血病中廣泛表達(dá):我們采用流式細(xì)胞術(shù)對10例健康供者、33例 AML及22例 ALL病人的骨髓單個核細(xì)胞進(jìn)行 TM-TNF-α表達(dá)的檢測,其中ALL患者 TM-TNF-α強陽性者約占86.36％,AML強陽性患者約占72％,其中15例 M5強陽性者占86.67％。提示部分白血病患者(約2/3)的白血病細(xì)胞高表達(dá) TM-TNF-α。

5、
　　2.比較正常干細(xì)胞和白血病干細(xì)胞對 TM-TNF-α的表達(dá):AML的CD34+CD38-干細(xì)胞 TM-TNF-α強陽性者占88.89％,而ALL的CD34+CD7-(CD19-)干細(xì)胞強陽性者占85.71％,但正常人 CD34+CD38-干細(xì)胞則幾乎不表達(dá) TM-TNF-α。白血病干細(xì)胞和白血病細(xì)胞表達(dá) TM-TNF-α呈正相關(guān)。
　　3.ALL表達(dá) TM-TNF-α與髓外浸潤相關(guān):有髓外浸潤的ALL細(xì)胞 TM-TNF

6、-α表達(dá)率較無髓外浸潤者高(p<0.05),提示 TM-TNF-α表達(dá)越高,越易出現(xiàn)白血病細(xì)胞的髓外浸潤。
　　4.干擾白血病細(xì)胞表達(dá) TNF-α,可抑制其增殖,促進(jìn)其凋亡:沉默 TNF-α表達(dá)后THP-1增殖減緩,并且凋亡稍有增高。
　　5.TM-TNF單抗誘導(dǎo) CDC和ADCC效應(yīng):與陰性對照美羅華相比,抗 TM-TNF-α抗體有一定 CDC(30％-35％)和ADCC效應(yīng)(40％-45％),與上市抗 S-TNF單抗類克

7、的效應(yīng)之間無明顯差異。
　　6.抗 TM-TNF-α抗體體內(nèi)殺傷效應(yīng):TM-TNF-α抗體治療組較美羅華對照組小鼠腫瘤發(fā)病率低,且成瘤體積減小,與類克治療組無明顯差異。
　　結(jié)論:TM-TNF-α在部分白血病中高表達(dá),且與白血病細(xì)胞增殖、浸潤密切相關(guān)。單獨使用TM-TNF-α抗體減少腫瘤發(fā)病率,并抑制腫瘤生長。本研究結(jié)果為以 TNF-α為靶點靶向治療白血病提供了實驗依據(jù)和新線索。
　　第三篇Tim-3未知配體的尋找及其

8、功能的初探
　　迄今為止,Tim-3分子發(fā)現(xiàn)的唯一配體是 galectin-9,本實驗室前期工作證實淋巴瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá) Tim-3可抑制T細(xì)胞活化和增殖,從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。為全面了解 Tim-3的信號途徑,本研究成功構(gòu)建表達(dá) sTim-3的原核和真核蛋白,并發(fā)現(xiàn)THP-1單核腫瘤細(xì)胞株表達(dá) galectin-9以外的配體。通過免疫共沉淀的方法和液相質(zhì)譜釣取與 sTim3共沉淀的膜受體,并初步探討 Tim3對其功能的影響。其

9、主要結(jié)果如下:
　　1.人 sTim3原核表達(dá)及檢測:我們采用分子克隆技術(shù),將人 Tim3胞外段基因序列按照細(xì)菌嗜好密碼修改,插入原核表達(dá)載體 pet28a+中,成功進(jìn)行原核表達(dá)。其表達(dá)sTim3可與兩種淋巴瘤細(xì)胞系 Su及Hut78表面結(jié)合。
　　2.人 sTim3-IgG1CH融合蛋白真核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá):利用重疊 PCR技術(shù)將 Tim3的信號肽和胞外段基因序列連接(sTim3),又將 sTim3與 IgG1重鏈恒定區(qū)

10、基因序列連接(sTim3-IgG1CH),并插入真核表達(dá)載體 pIRES2-EGFP。將該質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn) CHO細(xì)胞,經(jīng)流式和免疫印跡證實 CHO細(xì)胞表達(dá)并分泌 sTim3-IgG1CH融合蛋白。
　　3.用sTim3-IgG1CH融合蛋白篩選表達(dá) Tim3未知配體的細(xì)胞株:用流式分別檢測八種白血病細(xì)胞系,其中HL-60、Kassumi、RS4-11、Raji、Su的galectin9的表達(dá)率與 sTim-3-IgG1CH同細(xì)胞的結(jié)合率

11、基本一致;而THP-1表達(dá) galectin-9僅55％,但sTim3-IgG1CH與細(xì)胞的結(jié)合率則達(dá)到99％,提示 THP-1可能表達(dá) Tim3未知配體。
　　4.免疫共沉淀釣取 Tim3未知配體:用免疫共沉淀和和液相質(zhì)譜釣取與sTim3-IgG1CH共沉淀的膜受體,證實除了galectin-9外,還有 galectin-1及galectin-8,同時還獲得 Tim3信號途徑中T細(xì)胞活化抑制分子1。
　　5.sTim3-I

12、gG1CH融合蛋白對 THP-1細(xì)胞的作用:利用CBA試劑盒觀察sTim3-IgG1CH對 THP-1分泌細(xì)胞因子的影響,證實 sTim3可明顯抑制THP-1細(xì)胞分泌 TNF-α,對 IL-10分泌有輕度促進(jìn)作用。
　　結(jié)論:本研究初步證實 Tim3結(jié)合的未知受體可能是 galectin家族成員;sTim3明顯抑制單核細(xì)胞分泌 TNF-α,提示 Tim3有可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向 M2型轉(zhuǎn)化。但是,這些結(jié)論還需用大量實驗進(jìn)一步證實。本研