細胞周期檢測點激酶作為白血病治療靶點有效性的研究.pdf

1、該課題在于研究Chk1/2在白血病骨髓單個核細胞中表達情況,評價Chk1/2與白血病發(fā)生的關(guān)系,同時設(shè)計合成Chk1/2反義寡核苷酸,研究Chk1/2反義寡核苷酸對藥物誘導下白血病細胞株及白血病病人骨髓單個核細胞凋亡的影響,探討Chk1及Chk2作為白血病治療靶點的可能性和有效性. 第一部分:Chk1/2在白血病中的表達及意義;目的:探討Chk1/2在白血病中的表達及生物學意義.方法:用RT-PCR方法、共聚焦顯微鏡及免疫組織化學方法檢

2、測Chk1/2的mRNA和蛋白 在白血病細胞株K562及白血病病人骨髓細胞中的表達.結(jié)果:Chk1/2在K562細胞及白血病骨髓單個核細胞的細胞漿和細胞核中均有表達, 白血病組與非白血病組細胞Chk1/2的mRNA水平及細胞核中蛋白水平表達無顯 著差異,而細胞漿中蛋白表達有顯著差異. 第二部分:藥物和放射對K562細胞周期影響的研究;目的:觀察化療藥物和放射對細胞周期及凋亡的影響.方法:以不同劑量的藥物或放射處理細胞,用流式細胞儀檢測處

3、理后不同時間細胞周 期變化.結(jié)果:不同的損傷刺激下,細胞周期變化呈現(xiàn)不同的規(guī)律.10μM的DDP作用30小時以S期阻滯最明顯,作用時間繼續(xù)延長,S期細胞迅速下降,細胞凋亡率迅速增加.低劑量的ADM(0.17μM)以G2/M阻滯為主,隨著濃度增加,S期阻滯逐漸明顯,1.36μM的ADM作用48小時S期阻滯最明顯,作用時間繼續(xù)延長,S期細胞迅速下降,細胞凋亡率迅速增加.第三部分:Chk1/2反義寡核苷酸增強藥物誘導的K562細胞凋亡的研究.

4、目的:觀察Chk1/2反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染K562細胞后對藥物誘導下凋亡的影響.方法:以脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染載體,轉(zhuǎn)染不同劑量的FITC標記的寡核苷酸,熒光倒置顯 微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,用流式細胞儀檢測最佳轉(zhuǎn)染條件時轉(zhuǎn)染率,用western blot 和共聚焦顯微鏡檢測最佳轉(zhuǎn)染條件下Chk1和Chk2反義寡核苷酸對Chk1和Chk2蛋白表達的影響.結(jié)果:Chk1反義寡核苷酸對K562細胞中Chk1蛋白表達有明顯抑制作用,Chk2反義寡 核苷酸對Chk

5、2蛋白有一定抑制作用.轉(zhuǎn)染Chk1/2反義寡核苷酸可明顯增加DDP 誘導下K562細胞凋亡率,Chk1和Chk2聯(lián)合轉(zhuǎn)染作用優(yōu)于單獨轉(zhuǎn)染.第四部分:Chk1/2反義寡核苷酸增強藥物誘導的原代白血病細胞凋亡的研究.目的:評價Chk1/2反義寡核苷酸對DDP誘導的白血病原代細胞凋亡的影響.方法:選擇一例診斷明確的白血病作研究對象,分離骨髓單個核細胞,用含10﹪胎牛 血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng).用RT-PCR方法、免疫組化及western bl

6、ot方法檢 測Chk1和Chk2的表達.用不同濃度的DDP處理原代細胞,流式細胞儀檢測處 理不同時間后細胞周期的變化.按第三部分介紹的方法分組處理,用AnnexinV及PI法檢測各組細胞凋亡率.結(jié)果:在被檢測的一例原代細胞中,Chk1及Chk2的mRNA和蛋白表達均陽性,但免疫 組化發(fā)現(xiàn)Chk1在細胞漿和胞核中均為陽性表達,但Chk2僅在胞漿中弱陽性表 達,在胞核中表達為陰性.10μM的DDP處理細胞以G1期阻滯為主,作用時間 延長出現(xiàn)

7、短暫的S期阻滯.轉(zhuǎn)染Chk1反義寡核苷酸可明顯增加DDP誘導下原 代細胞凋亡率,但轉(zhuǎn)染Chk2反義寡核苷酸未能明顯增加DDP誘導原代細胞凋 亡率,Chk1和Chk2聯(lián)合轉(zhuǎn)染作用不優(yōu)于單獨轉(zhuǎn)染CHk1反義寡核苷酸.第五部分:秋水仙胺和長春新堿對K562細胞plk1和γ-tubulin表達影響的研究;目的:研究秋水仙胺和長春新堿對K562細胞plk1和γ-tubulin表達影響及plk1和 γ-tubulin的關(guān)系.方法:采用western