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文檔簡介
1、目的:
研究認為白血病患者體內(nèi)存在一群極微量的細胞群,這些細胞通常對化療藥物不敏感,能夠逃逸化學藥物的殺傷作用;同時具有一定的自我更新能力使其可以在體內(nèi)維持白血病的生成,從而成為白血病復發(fā)和耐藥的根源。這群白血病細胞被稱為白血病干細胞(Leukemia stem cells,LSCs)。只有有效清除LSCs,才能從根本上治愈白血病。發(fā)現(xiàn)并研究LSCs上特異性表達的分子抗原,對LSCs的生物學特性研究以及白血病治療都具有重要意義
2、。前期實驗初步表明,本實驗室自行研制的3A4單克隆抗體對急性髓系白血病干細胞(CD34+CD38-CD123+)具有較強的識別能力。在此基礎(chǔ)上,我們對3A4單抗靶向的3A4抗原的生物學特性進行全面和深入的分析,探討3A4抗原作為AML LSCs靶點的可能性,為白血病靶向治療提供新的途徑。本課題進行了如下四個部分內(nèi)容的研究:(1)3A4抗原表達規(guī)律的分析;(2)3A4抗原表位的研究;(3)3A4抗原相關(guān)干細胞特性的研究;(4)3A4-高三
3、尖杉酯堿抗體偶聯(lián)物的制備及其靶向殺傷活性檢測。
方法:
1.3A4抗原表達規(guī)律的分析
1.1 3A4及相關(guān)抗原在白血病干細胞及各亞群細胞上的表達:(1)流式細胞術(shù)檢測3A4抗原、3A4的相關(guān)同型抗原(CD45RA、CD45和CD45RO)以及干/祖細胞相關(guān)抗原(CD33、CD44、CD123、CD133、CD19和HLA-DR)在兒童白血病患者骨髓LSCs、正常造血干細胞(Hematopoietic ste
4、m cells,HSCs)及各亞群細胞上的表達情況。其中ALL37例(31例B-ALL,6例T-ALL),AML54例(4例M0-M1,14例M2,5例M3,29例M4-M5,2例M6),CML6例。11例特發(fā)性血小板減少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)患者作為對照。(2)流式細胞術(shù)檢測3A4抗原及上述抗原在10例AML和10例B-ALL復發(fā)白血病患者骨髓白血病細胞上的表達。(3)
5、細胞定義:LSCs和HSCs以CD34+CD38-Lin-細胞群定義,各亞群細胞分別指CD34-、CD34+CD38+、CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-細胞。
1.2 3A4抗原在多器官正常組織和腫瘤組織的分布情況:通過組織微陣列技術(shù)結(jié)合免疫組化法檢測3A4抗原在99例多器官正常組織和96例多器官腫瘤組織上的表達。
2.3A4抗原表位的研究
2.1 CD45RC各截短型真核表達載體的構(gòu)建及
6、表達:根據(jù)CD45基因6號外顯子基因序列(CD45RC)構(gòu)建4個不同的截短型真核表達載體,分別命名為pcDNA3.1+/CD45RC-1(包含6號外顯子前99bp)、pcDNA3.1+/CD45RC-2(包含6號外顯子后99bp)、pcDNA3.1+/CD45RC-3(包含6號外顯子前48bp)和pcDNA3.1+/CD45RC-4(包含6號外顯子后48bp);將空載體pcDNA3.1+、未截短型pcDNA3.1+/CD45 RC以及構(gòu)
7、建成功的上述4個截短型真核表達載體分別經(jīng)轉(zhuǎn)染級抽提試劑盒抽提質(zhì)粒后,經(jīng)LipofectamineTM2000試劑盒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將上述質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CHO細胞;通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后CHO細胞目的基因的表達;采用流式細胞術(shù)和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后CHO細胞膜上的CD45RC各截短體蛋白的表達情況。
2.2 表位肽掃描法測定3A4抗原表位:根據(jù)CD45基因6號外顯子編碼的氨基酸序列采用固相合成法合成一條多肽片段
8、(序列為DVPGERSTASTFPTDPVSPL TTTLSLAHHS SAALPARTSN TTITANTSD);采用質(zhì)譜法(Massspectrometry,MS)及高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測合成的多肽抗原的正確性及純度;根據(jù)間接酶聯(lián)免疫吸附分析法(Indirect enzyme linked immunosorbent assay,iELISA)分析
9、該抗原多肽與3A4抗體的結(jié)合能力。
3.3A4抗原相關(guān)干細胞特性研究
3.1 體外實驗測定3A4抗原相關(guān)干細胞特性:間接免疫磁珠法分選3A4陽性和3A4陰性Kasumi細胞和HL60細胞;BrdU滲入法標記3A4陽性和3A4陰性白血病細胞的增殖狀態(tài);CCK-8法和AnnexinⅤ-PI染色法檢測化療藥物作用下3A4陽性和3A4陰性白血病細胞的增殖狀態(tài)和抗凋亡能力。
3.2 體內(nèi)實驗測定3A4抗原相關(guān)干細胞特
10、性:通過3A4抗體封閉自血病細胞株(KG1a細胞和Nalm-6細胞)和人骨髓單個核細胞表面的3A4抗原,觀察經(jīng)過3A4抗體封閉和未封閉的兩群細胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤能力的差異;通過間接免疫磁珠法分選3A4陽性和3A4陰性的AML患者骨髓單個核白血病細胞,比較這兩群細胞在NOD/SCID小鼠異體移植成瘤能力的差異。
4.3A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物的制備及靶向殺傷活性檢測:
4.1 3A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物的
11、制備:異型雙功能交聯(lián)劑(SPDP和SMCC)修飾3A4抗體的半胱氨酸(Cysteine,Cys)富含的巰基(-SH)或賴氨酸(Lysine,Lys)殘基富含的氨基(-NH2);硫脲法將高三尖杉酯堿(Homoharringtonine,HHT)的末端羥基(-OH)巰基化;修飾后的3A4抗體與巰基化HHT4℃過夜結(jié)合反應;BCA測定3A4-HHT偶聯(lián)藥物蛋白濃度;流式細胞儀測定3A4-HHT偶聯(lián)藥物的活性。
4.2 3A4-HHT
12、抗體偶聯(lián)藥物靶向殺傷活性檢測:采用CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒檢測不同濃度(0、1、2、4、8、16、32μg/ml)3A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物在不同作用時間(24h、48h和72h)下對KG1a細胞和Nalm-6細胞的靶向殺傷活性。
結(jié)果:
1.3A4抗原表達規(guī)律的分析
1.1 3A4及相關(guān)抗原在白血病干細胞及各亞群細胞上的表達:(1)3A4抗原在AML LSCs上的表達水平明顯高于HSCs,中
13、位表達水平分別為94.8% vs.21.8%,P<0.0001;且3A4抗原在54例AML患者的LSCs上均為陽性表達。(2)3A4抗原在AML和B-ALL復發(fā)白血病患者的白血病細胞上具有較強的表達,中位表達水平分別為(90.9±4.9)%和(81.7±9.1)%。(3)3A4抗原在各亞型AML LSCs上的表達水平分別為(92.3±3.3)%[M0-1]、(95.1±1.5)%[M2]、(46.4±13.8)%[M3]、(85.2+4
14、.3)%[M4-5]和(61.2±28.9)%[M6],以M0-1和M2型白血病上的抗原表達水平最高。(4)3A4抗原在正常CD34+CD38+細胞上較其他細胞亞群(CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-)相對高表達,而在AML CD34+CD38+、CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-各細胞群上的表達無明顯差異。(5)3A4抗原在AML LSCs和HSCs上的表達選擇性明顯高于CD33、CD123、CD133
15、、CD44和HLA-DR抗原。
1.2 3A4抗原在多器官正常組織和腫瘤組織器官的分布情況:(1)3A4抗原主要在脾臟、扁桃體和胸腺等淋巴組織器官上表達,在甲狀旁腺、小腸、結(jié)腸、胃等組織上主要限制表達于淋巴組織處,在重要器官組織(如腦、心、肝、肺、腎、生殖器官)上基本不表達。(2)3A4抗原主要在腸、脾、甲狀腺、淋巴結(jié)等淋巴組織處發(fā)生的B細胞性淋巴瘤、B細胞性細胞瘤、何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤上高表達,在T細胞性淋巴瘤上
16、基本不表達。
2.3A4抗原表位的研究
2.1 CD45RC各截短型真核表達載體的構(gòu)建及表達:(1)真核表達載體pcDNA3.1+/CD45RC-1、 pcDNA3.1+/CD45RC-2、 pcDNA3.1+/CD45RC-3和pcDNA3.1+/CD45RC-4經(jīng)搖菌擴增提取質(zhì)粒DNA后,酶切及測序結(jié)果顯示構(gòu)建的載體分別包含相應的目的基因片段,表明CD45RC的4個截短型真核表達載體構(gòu)建成功。(2) RT-PCR
17、結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的各截短型CD45RC CHO細胞中存在CD45基因表達,表明各轉(zhuǎn)染的CHO細胞在轉(zhuǎn)錄水平上成功表達CD45基因,轉(zhuǎn)染后細胞分別命名為CD45RC-1 CHO、CD45RC-2 CHO、CD45RC-3 CHO和CD45RC-4CHO。(3)流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn),4個截短型CD45RC CHO細胞均可檢測到3A4抗原的表達,表達水平分別為(36.7±6.9)%、(35.2±13.3)%、(43±7.9)%和(41.4±14.
18、2)%,各組間均無明顯統(tǒng)計學差異(P值均>0.05)。而Western blot法在CD45RC-1 CHO、CD45RC-2 CHO、CD45RC-3 CHO和CD45RC-4 CHO細胞上未能檢測到3A4抗體識別的抗原。
2.2 表位肽掃描法測定3A4抗原表位: MS結(jié)果顯示合成的多肽抗原分子量為4996.5,與理論分子量4996.35相近,從分子量水平上提示多肽合成正確;HPLC檢測結(jié)果顯示,合成的多肽抗原純度為70%左
19、右,符合下一步實驗要求;iELISA結(jié)果顯示,3A4抗體不能識別CD45基因6號外顯子編碼的氨基酸線性序列,提示3A4抗原表位可能為構(gòu)象型表位。
3.3A4抗原相關(guān)干細胞特性研究
3.1 體外實驗測定3A4抗原相關(guān)干細胞特性:3A4陽性Kasumi細胞和HL60細胞的增殖能力分別低于相應3A4陰性Kasumi細胞和HL60細胞的增殖能力,BrdU的表達水平分別為(4.6±1.9)% vs.(35.1±1)%,(P<0
20、.05)和(44.9±1.3)%vs.(74.4±2)%,(P<0.05);IC50和IC70作用濃度下的THP和Ara-C對3A4陽性Kasumi細胞和HL60細胞的抑制率均低于相應3A4陰性細胞(P值均<0.05),而IC50和IC70濃度下的HHT對這兩群細胞的抑制率均無明顯差異(P值均>0.05);在THP和Ara-C作用下,3A4陽性Kasumi細胞和HL60細胞的抗凋亡能力均高于相應的3A4陰性白血病細胞,而在HHT作用下兩
21、者的抗凋亡能力無明顯差異。
3.2 體內(nèi)實驗測定3A4抗原相關(guān)干細胞特性:經(jīng)尾靜脈注射5×106個Nalm-6細胞后,3A4抗體孵育組小鼠和鼠IgG抗體孵育組小鼠在植入15天以后,均開始出現(xiàn)行動遲緩,消瘦、后肢癱瘓或弓背等情況,流式和病理結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)存在白血病細胞浸潤,中位發(fā)病時間分別為18和22天。經(jīng)尾靜脈注射5×106個KG1a細胞后,鼠IgG抗體孵育組小鼠均生成白血病,成瘤率為100%(3/3),中位發(fā)病時間為58天
22、;3A4抗體孵育組小鼠生存狀態(tài)良好。
4.3A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物的制備及靶向殺傷活性檢測:BCA測定3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT偶聯(lián)物的蛋白濃度分別為0.2mg/ml和0.3mg/ml;流式結(jié)果顯示3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT對KG1a細胞的識別能力與裸抗3A4無明顯差異,分別為98.89%和94.68%; CCK-8結(jié)果顯示,在不同觀察時間和藥物濃度作用下,3A4-SPDP-H
23、HT和3A4-SMCC-HHT對Nalm-6細胞的抑制率均明顯低于KG1a細胞(P值均<0.05),說明3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT對靶細胞KG1a具有良好的選擇性殺傷作用。其中,3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT隨著作用濃度增加,對細胞的抑制作用亦逐漸增強,但不呈時間依賴性。
結(jié)論:
1.3A4抗原選擇性地高表達于AML LSCs,以M0-1和M2類型白血病最為明顯,而在正常H
24、SCs上弱表達。3A4抗原在AML LSCs和HSCs上的表達選擇性明顯高于CD33、CD123、CD133和CD44等抗原分子。此外在復發(fā)AML患者的骨髓白血病幼稚細胞上同樣具有較強的表達水平。
2.3A4抗原主要在淋巴相關(guān)組織器官及淋巴細胞上表達,在重要器官組織(如腦、心、肝、肺、腎和生殖器官等)上基本不表達。
3.3A4抗原表位主要為CD45基因6號外顯子編碼的蛋白區(qū)域,可能是構(gòu)象型表位。
4.3A4
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