短發(fā)夾基因干擾細(xì)胞周期檢測點激酶1-2表達(dá)對腦腫瘤干細(xì)胞放療敏感性的影響.pdf

1、本文內(nèi)容分為三部分：
　　第一部分
　　膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)及其干細(xì)胞特性的鑒定研究
　　目的：原代培養(yǎng)出具有干細(xì)胞特性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞并進(jìn)行體內(nèi)體外的鑒定,為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞靶向治療實驗奠定基礎(chǔ)。
　　方法：術(shù)中留取高級別膠質(zhì)瘤標(biāo)本(術(shù)后病理證實 WHOⅢ或以上膠質(zhì)瘤),組織胰酶消化法提取細(xì)胞,用懸浮神經(jīng)球培養(yǎng)方法培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Glioblastoma stem-like cell, GSC);免疫熒光法、RT-

2、PCR法檢測 GSCs表面標(biāo)志物,在裸鼠(Bulb/c nude mice)顱內(nèi)再次成瘤實驗檢測 GSCs成瘤性。對數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：在懸浮神經(jīng)球干細(xì)胞培養(yǎng)條件下,成功培養(yǎng)出成球生長的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球(GSC-Sph);RT-PCR、Western Blotting和免疫熒光檢測提示原代培養(yǎng)的GSCs高表達(dá)CD133(3.02％～4.92％); Western Blotting檢測提示 GSCs在蛋

3、白水平高表達(dá) Nestin;將原代培養(yǎng)的GSCs種植于裸鼠腦內(nèi),8周后成瘤,成功構(gòu)建裸鼠原位移植瘤模型。
　　結(jié)論：通過留取人高級別膠質(zhì)瘤原代懸浮神經(jīng)球干細(xì)胞培養(yǎng)方法可以得到具有干細(xì)胞特性的GSCs。其高表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD133和Nestin。GSCs原位種植于鼠腦8周后成瘤,原代 GSCs有成瘤性。
　　第二部分
　　shRNA-Chk1/2慢病毒載體的構(gòu)建及對 GSCs干擾效應(yīng)的研究
　　目的：構(gòu)建針

4、對細(xì)胞周期檢測點激酶1和2(Checkpoint kinase1/2, Chk1/2)基因的短發(fā)夾 RNA(shRNA)表達(dá)載體,包裝成慢病毒,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GSCs細(xì)胞株,為研究干擾 Chk1或 Chk2基因的表達(dá)對治療腦膠質(zhì)瘤的方法研究提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：從 GenBank數(shù)據(jù)庫中查找 Chk1和Chk2基因的核苷酸序列,根據(jù)所查序列分別設(shè)計出能轉(zhuǎn)錄的短發(fā)夾樣 RNA(shRNA)的DNA序列,命名為 Chk1-shRN

5、A和Chk2-shRNA,同時設(shè)計1條陰性對照 DNA序列,命名為 negative-shRNA,設(shè)計的序列合成后與 pLKO.1-TRC質(zhì)粒載體連接,構(gòu)建質(zhì)粒,并包裝慢病毒。重組表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染原代 GSCs,用嘌呤霉素篩選后擴增獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶連反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡(Western blot)分別在核酸水平及蛋白水平上檢測 Chk1和Chk2的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建重組質(zhì)粒后,利用限制性酶切

6、位點和瓊脂糖凝膠電泳鑒定 shRNA片段成功插入到預(yù)定位點;送公司進(jìn)行基因序列檢測,與設(shè)計序列一致。利用嘌呤霉素抗性對轉(zhuǎn)染慢病毒后的GSCs細(xì)胞篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒的細(xì)胞,干擾 Chk1組和干擾 Chk2組細(xì)胞 Chk1和Chk2的表達(dá)情況在 mRNA水平和蛋白水平上顯著低于陰性對照組。
　　結(jié)論：構(gòu)建了干擾 Chk1或 Chk2基因的shRNA慢病毒載體,成功轉(zhuǎn)染 GSCs后可抑制Chk1或 Chk2基因的表達(dá),為下一步探討

7、Chk1和(或) Chk2基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。
　　第三部分
　　干擾 Chk1/2對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療敏感性的研究
　　目的：研究干擾 Chk1/2基因表達(dá)對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療抵抗性的影響,為膠質(zhì)瘤的靶向基因治療提供新的途徑。
　　方法：從 GenBank數(shù)據(jù)查找出 Chk1和Chk2基因的DNA序列,并以此各設(shè)計1條短發(fā)夾基因 RNA(Small hairpin RNA, shRNA)的

8、DNA序列,構(gòu)建慢病毒并轉(zhuǎn)染GSCs進(jìn)行傳代擴增。用RT-PCR和Western blot方法分別在核酸和蛋白水平上測定Chk1及Chk2的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后的GSCs經(jīng) X照射后,進(jìn)行細(xì)胞周期和凋亡的檢測。
　　結(jié)果：RT-PCR和Western blot提示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 Chk1-shRNA和Chk2-shRNA細(xì)胞在蛋白和mRNA水平上 Chk1和Chk2的表達(dá)被抑制。放療后,細(xì)胞周期檢測提示對照組60.28±1.28％阻滯在 G2/

9、M期,而Chk1-shRNA組細(xì)胞僅22.37±2.01％在 G2/M期,與未放療組細(xì)胞23.77±2.31％相差不大( P>0.05);Chk1-shRNA組細(xì)胞放療后的凋亡率較對照組和Chk2-shRNA組細(xì)胞高,而對照組與 Chk2-shRNA組之間差異無顯著性意義。
　　結(jié)論：慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以有效的將干擾 Chk1和干擾 Chk2基因帶到 GSCs并發(fā)揮作用,干擾 Chk1可以增加放療對 GSCs的敏感性,為膠質(zhì)瘤的治療