節(jié)律基因mPer2對腫瘤細胞γ射線損傷敏感性的影響及其擇時放療的初步研究.pdf

1、目的： 放射治療是腫瘤治療的主要手段之一，大約70％的腫瘤患者需要放療的介入。理論上，足夠大的放射劑量能夠殺死所有腫瘤細胞，但周圍正常組織的放射損傷限制了腫瘤治療劑量的進一步增加，在有限治療劑量下，尋求能夠影響細胞對射線敏感性的干預措施，無疑將對腫瘤的治療具有重要意義。時間生物學研究發(fā)現(xiàn)，生物體正常組織及腫瘤組織在細胞生理、生化等生長代謝的生命活動中均存在生物節(jié)律性，根據(jù)生物體的節(jié)律特征進行施治，已證實可以提高療效并且降低機體對

2、治療措施本身的毒副反應。本課題即首先探討了主要生物節(jié)律基因之一mPer2對<'60>Co-γ射線敏感性的影響，通過對細胞增值以及DNA損傷程度對mPer2影響細胞射線敏感性的高低作出判斷，進而在體內(nèi)、體外腫瘤細胞mPer2節(jié)律表達的不同時間對細胞及荷瘤動物進行照射，觀察擇時放射對腫瘤細胞及腫瘤組織生長情況以及不同時間照射對小鼠毒副作用的影響，最后采用分子生物學、細胞生物學的研究方法對mPer2在射線照射過程中對其下游鐘控基因，包括DNA

3、損傷修復基因，細胞增殖、凋亡等相關基因表達的調(diào)控及可能的信號傳導通路進行探討，闡明節(jié)律基因mPer2影響細胞射線損傷敏感性的分子作用機制，為腫瘤的治療開辟新的途徑。 方法： 1采用脂質(zhì)體介導的方法將構建好的mPer2基因重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-mPer2轉染入腫瘤細胞，并以pcDNA3.1（+）-vector空載體及單獨加入脂質(zhì)體空白組為對照，通過克隆形成實驗檢測不同劑量照射下細胞的克隆形成率，進一步通過生存

4、擬合曲線得出相應放射生物學參數(shù)（Do、Dq及N值），同時通過DNA斷片分析及單細胞凝膠電泳實驗觀察不同組細胞受射線照射后DNA損傷程度，從而對細胞內(nèi)mPer2高表達影響細胞對γ射線敏感性的高低變化作出判斷： 2．根據(jù)PMA可在體外刺激培養(yǎng)的細胞近日鐘基因節(jié)律表達，結合第一部分的研究結果，首先在體外對腫瘤細胞進行擇時照射，選擇PMA刺激后腫瘤細胞內(nèi)mPer2節(jié)律表達的高峰與低谷的不同時間給予腫瘤細胞γ射線照射，通過克隆形成、細胞增

5、殖核抗原免疫組化觀察細胞生長、增殖以及通過單細胞凝膠電泳觀察不同時間照射組細胞DNA損傷的情況；體內(nèi)研究，采用授時因子發(fā)生儀對荷瘤小鼠進行光暗周期程控調(diào)控，在腫瘤組織mPer2表達的峰值與谷值給予小鼠<'60>Co-γ射線照射，觀察不同時間照射組腫瘤生長的抑制情況，腫瘤組織石蠟切片HE染色以及PCNA免疫組化觀察不同時間照射組腫瘤組織細胞的形態(tài)及增值情況，通過體重、生存曲線觀察不同時間照射組小鼠的毒副反應程度； 3．通過流式細胞

6、術檢測不同組細胞受射線照射后細胞周期阻滯及凋亡，通過單細胞凝膠電泳檢測不同組細胞DNA損傷修復情況，以及通過分子生物學方法RT-PCR了解凋亡相關基因p53、bcl-2、bax、c-myc以及DNA損傷修復基因Rad51在不同組細胞的表達變化，探討節(jié)律基因mPer2對細胞γ射線損傷敏感性變化的分子作用機制。 結果： 通過脂質(zhì)體介導的方法成功將構建好的mPer2基因重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-mPer2轉染入腫瘤細

7、胞，轉染效率達到70％以上，通過克隆形成率擬合生存曲線得到放射生物學參數(shù)Do、Dq值mPer2轉染組較對照組高，外推數(shù)N值變小，單細胞凝膠電泳顯示mPer2轉染組拖尾率（彗星細胞出現(xiàn)率）及尾長均較對照組低，提示mPer2高表達使細胞對射線損傷的敏感性降低；通過PMA刺激誘導腫瘤細胞mPer2節(jié)律表達，在其表達的高峰與低谷的不同時間進行照射，細胞同樣表現(xiàn)出上述趨勢，對程控光照的荷瘤小鼠進行不同時間照射，PCNA免疫組化顯示，mPer2高表

8、達組較低表達組腫瘤組織細胞內(nèi)細胞增值較明顯；雖然兩組小鼠體重及生存期沒有明顯差異，但mPer2表達高峰組腫瘤抑制不如表達低谷組，表達低谷組在照射后表現(xiàn)出明顯再生長延緩；通過流式細胞術檢測，mPer2高表達組照射后細胞出現(xiàn)明顯G2／M期阻滯，凋亡率較低，單細胞凝膠電泳顯示損傷后1小時mPer2高表達組細胞DNA即出現(xiàn)明顯修復，RT-PCR表明，mPer2高表達組顯示細胞受照射后較對照組修復基因mRad51表達增高，p53增高不如對照組明顯

9、、bax表達明顯降低，bcl-2，c-myc表達明顯增加，bcl-2/bax比值增加。 結論： 細胞內(nèi)mPer2高表達可降低細胞對<'60 > Co-r射線損傷的敏感性，使細胞存活比率增加，流式細胞術、單細胞凝膠電泳、RT-PCR檢測分析表明mPer2高表達使照射后細胞周期阻滯于G2/M期以提供給DNA損傷修復的時機，同時增加修復基因、降低凋亡相關基因的表達是其分子作用機制所在。進一步對體外、體內(nèi)腫瘤細胞進行擇時放療，證