核孔蛋白與核磷蛋白——天然藥物治療急性白血病的新型分子靶點(diǎn).pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分、魚藤素對(duì)Jurkat 白血病細(xì)胞核孔蛋白與核磷蛋白的調(diào)節(jié)作用 目的：研究魚藤素對(duì)白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 方法：以人類T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat 作為研究對(duì)象，采用MTT 法檢測細(xì)胞增殖活性；DNA ladder 法、Hoechst33258 染色法和Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)、W

2、estern Blot、RT-PCR 檢測魚藤素作用前后，Jurkat細(xì)胞內(nèi)核孔蛋白Nup88、Nup214 與核磷蛋白(nucleophosmin，NPM)表達(dá)水平的變化；激光共聚焦顯微技術(shù)觀察上述核孔蛋白與核磷蛋白的亞細(xì)胞定位情況。 結(jié)果：（1）魚藤素以劑量、時(shí)間依賴性方式抑制Jurkat細(xì)胞的增殖，其24 h的IC50是46.03±0.13 nmol/L。（2）魚藤素以劑量依賴性方式誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，40 nmol

3、/L的魚藤素處理24 h 后出現(xiàn)明顯的DNA 剪切現(xiàn)象，伴有典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，其總凋亡率達(dá)(19.87±1.76)％。（3）魚藤素能同時(shí)在蛋白和基因水平，以劑量依賴性方式抑制核孔蛋白Nup88、Nup214 以及核磷蛋白NPM的表達(dá)。 結(jié)論：魚藤素能明顯抑制Jurkat細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。其抗白血病效應(yīng)可能與其下調(diào)核孔蛋白Nup88、Nup214 以及核磷蛋白NPM的表達(dá)有關(guān)。 第二部分、藤黃酸對(duì)白血病細(xì)胞的

4、增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響 目的：研究藤黃酸對(duì)人類多種白血病細(xì)胞系的體外抗腫瘤作用。 方法：以HL-60（人急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株）；U937（人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株）；K562（人慢性髓系白血病急變細(xì)胞株）為研究對(duì)象，采用MTT 法檢測藤黃酸對(duì)三種白血病細(xì)胞系增殖活性的影響；Hoechst33258 染色法和AnnexinV-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡；PI 單染色法測定藤黃酸對(duì)三種白血病細(xì)胞系增殖周期的影

5、響。 結(jié)果：（1）藤黃酸對(duì)HL-60、U937、K562 三種白血病細(xì)胞系均具有明顯的抑制增殖作用。其中，HL-60細(xì)胞最為敏感，而K562細(xì)胞對(duì)藤黃酸的敏感性相對(duì)較差。（2）藤黃酸均能誘導(dǎo)HL-60、U937、K562細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡，呈明顯的劑量依賴性。其中，HL-60 對(duì)藤黃酸尤為敏感，經(jīng)1.6 μmol/L的藤黃酸干預(yù)12 h 后，一半以上的HL-60細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，其總凋亡率高達(dá)(77.84±2.38)％；而藤

6、黃酸對(duì)U937和K562細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用相對(duì)較弱。（3）藤黃酸對(duì)三種白血病細(xì)胞系的周期調(diào)控作用并不完全一致，U937和K562細(xì)胞經(jīng)藤黃酸誘導(dǎo)后被阻滯于G0/G1期，S期細(xì)胞相應(yīng)減少；相對(duì)而言，HL-60細(xì)胞的增殖周期并不受藤黃酸干預(yù)的影響，即使在出現(xiàn)顯著細(xì)胞凋亡峰的情況下，仍未見明顯的細(xì)胞周期的改變。 結(jié)論：藤黃酸對(duì)多種白血病細(xì)胞系均有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。其中，HL-60細(xì)胞對(duì)藤黃酸的抗白血病效應(yīng)最為敏感。此外，藤

7、黃酸也不是對(duì)所有白血病細(xì)胞均有誘導(dǎo)周期阻滯作用，HL-60細(xì)胞可能在其發(fā)生周期阻滯前即已凋亡。推測藤黃酸的抗白血病效應(yīng)在不同細(xì)胞系中存在較大差異。 第三部分、藤黃酸對(duì)Jurkat 白血病細(xì)胞核孔蛋白與核磷蛋白的調(diào)節(jié)作用 目的：研究藤黃酸對(duì)白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 方法：以人類T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat 作為研究對(duì)象，采用MTT 法檢測細(xì)胞增殖活性；H

8、oechst33258 染色法和Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot、RT-PCR、檢測藤黃酸作用前后，Jurkat細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bcl-xL、核孔蛋白Nup88、Nup214、Nup98 與核磷蛋白NPM的表達(dá)水平；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和激光共聚焦顯微技術(shù)觀察核孔蛋白與核磷蛋白的亞細(xì)胞定位情況。 結(jié)果：（1）藤黃酸以時(shí)間、劑量依賴性方式抑制Jurkat細(xì)胞增殖

9、，其24 h的IC50為1.822±0.148 μmol/L。（2）藤黃酸以劑量依賴性方式誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，伴有典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。此外，凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)也隨之減少。（3）藤黃酸以劑量依賴性方式下調(diào)Jurkat細(xì)胞內(nèi)核孔蛋白Nup88、Nup214、Nup98 與核磷蛋白NPM的表達(dá)水平。核孔蛋白Nup88 與Nup214的亞細(xì)胞定位經(jīng)藤黃酸干預(yù)后也發(fā)生了細(xì)微的變化。 結(jié)論：藤黃酸能夠抑制