解析“未知”型癲癇的生物標(biāo)志物hsA-miR-1275及其靶基因研究.pdf

1、未知型癲癇(unknown-causedepilepsy)又稱隱源性癲癇(cryptogenic epilepsy)，是指在臨床上表現(xiàn)為癥狀性癲癇(symptomatic epilepsy)，然而以目前的臨床診斷水平又無法查出明確病因。往往在特定的年齡段起病，無特殊的臨床和腦電圖特征。因此，分子機(jī)理與治療的研究不夠全面。microRNAs作為內(nèi)源性非編碼RNA(non-coding RNA)家族的成員之一，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平。miR

2、NA在不同組織和發(fā)育階段具有時空表達(dá)差異性，影響各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。目前，未見miRNA與未知型癲癇的相關(guān)研究報(bào)道。本文，我們首次應(yīng)用miRNA芯片篩選了全血的miRNA生物標(biāo)志物hsa-miR-1275。而且確定了部分靶基因MECP2，SV2A，GABA受體，離子通道相關(guān)基因等。這為臨床診斷和治療提供重要線索。
　　為此，本課題的主要工作和研究結(jié)果如下:(1)建立生物樣本庫。收集癲癇和正常對照人群的體液樣本，包括血液、腦脊液

3、，建立癲癇的生物樣本庫。(2)未知型癲癇生物標(biāo)志的芯片數(shù)據(jù)初期篩選:通過microRNA生物芯片對未知型癲癇和正常對照組的血液中的microRNA進(jìn)行芯片雜交，再通過芯片數(shù)據(jù)分析軟件分析表達(dá)差異明顯的microRNA(n=20，fold change value＞30)，其中有18個上調(diào)，2個下調(diào)，篩選出未知型癲癇的候選生物標(biāo)志物。(3)對候選標(biāo)志物hsa-miR-1275、miR-764的功能和靶基因分析:通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測他們

4、的神經(jīng)生物學(xué)功能和靶基因特點(diǎn)。對基因進(jìn)行Gene Ontology和KEGG富集分析以了解這些差異基因的生物學(xué)功能和參與的信號通路。(4)芯片數(shù)據(jù)驗(yàn)證。通過Taqman探針RT-PCR實(shí)驗(yàn)對未知型癲癇的血清和腦脊液的microRNA，進(jìn)行相對定量比較。發(fā)現(xiàn)hsa-miR-1275在血清中高表達(dá)(p＜0.001)，在腦脊液低表達(dá)(p＜0.001)。(5)hsa-miR-1275調(diào)控靶基因MECP2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá):MECP2的3'-UTR存在

5、多個被hsa-miR-1275靶向調(diào)控額位點(diǎn)，且具有較高的物種保守性。實(shí)時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MECP的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)都受到hsa-miR-1275的調(diào)控影響。(6)初步探討hsa-miR-1275可能參與的信號通路:hsa-miR-1275過表達(dá)可激活NF-κB轉(zhuǎn)錄水平。(7)hsa-miR-1275對細(xì)胞功能的影響:hsa-miR-1275異常表達(dá)影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的細(xì)胞周期，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。