α-鵝膏毒肽給藥小鼠差異表達(dá)基因的鑒定及其拮抗藥物的篩選.pdf

1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文α鵝膏毒肽給藥小鼠差異表達(dá)基因的鑒定及其拮抗藥物的篩選姓名：劉軍申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：楊志榮20050425n—amanilin給藥小鼠差異表達(dá)基因的克隆鑒定及且拈抗藥物篩選研究具有時(shí)間依賴性，尾靜脈給藥48h后，血漿和脾臟中已經(jīng)檢測不到cc鵝膏毒肽，但在肝臟和腎臟組織中可檢測到n一鵝膏毒肽積累。由此可見，毒素伐一鵝膏毒肽在中毒一段時(shí)間后，對主要臟器肝臟和‘腎臟有直接的毒性作用。運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技

2、術(shù)篩選u一鵝膏毒肽作用前后的差異表達(dá)基因，為研究a一鵝膏毒肽作用機(jī)理、相關(guān)基因及臨床診斷和拮抗藥物篩選奠定基礎(chǔ)；并可以從不同角度、不同層次對Ⅱ一鵝膏毒肽的毒性作用進(jìn)行理論闡釋。用抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建了位一鵝膏毒肽作用前差異表達(dá)基因的差減cDNA文庫(正向差減文庫)和正正常生理狀態(tài)下差異表達(dá)基因的差減cDNA文庫(反向差減文庫)。從差減cDNA庫中隨機(jī)挑耿400個(gè)克隆進(jìn)行了PCR篩選，得到166個(gè)差異表達(dá)cDNA片段。再通過斑

3、點(diǎn)雜交篩選，得到85個(gè)陽性差異表達(dá)cDNA片段，正向差減和反向差減差異表達(dá)cDNA片段分別為42和45個(gè)。隨即挑選9個(gè)cDNA克隆測序，將所測序列經(jīng)GenBank檢索，將所測序列與GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性比較與分析，發(fā)現(xiàn)正向差減篩選到的基因片段分別為AK013055、AK013732、NM007645、N1“_013520、NM016974、NM_021718：反向差減篩選到的基因片段分別為D14716、NM、。_00756

4、3NM019946在抑制消減雜交和基因芯片技術(shù)對甜鵝膏毒肽作用小鼠進(jìn)行差異表達(dá)基因研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇具有功能代表性的幾種差異表達(dá)基因，然后運(yùn)用半定量PCR技術(shù)篩選對Ⅱ鵝膏毒肽作用具有拮抗作用藥物，建立針對旺鵝膏毒肽毒性作用的拮抗藥物的快速篩選方法。在待篩選拮抗藥物干預(yù)后，小鼠的臨床癥狀出現(xiàn)不同的變化，尤其以水飛薊素干預(yù)組、赤靈芝干預(yù)組表現(xiàn)突出，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠與a一鵝膏毒肽中毒組相比，表現(xiàn)活躍，動(dòng)作迅捷。比較各實(shí)驗(yàn)組小鼠體

5、重的變化數(shù)據(jù)，各組小鼠在d一鵝膏毒肽給藥12h后體重就出現(xiàn)了明顯下降，雙尾檢驗(yàn)，差異及顯著。水飛薊索干預(yù)組、赤靈芝干預(yù)組和蘇麻組小鼠體重在藥物干預(yù)至36h后，體重有了明顯恢復(fù)，差異不顯效。半定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各種干預(yù)藥物對Ct一鵝膏毒肽作用引起的變化基因有不同水平的影響。，水飛薊素、赤靈芝和紫蘇／甘草對上調(diào)的基因CatnB有明顯的恢復(fù)下調(diào)，CainB的轉(zhuǎn)錄量與內(nèi)參B—actin比值分別為071、080和O85，遠(yuǎn)低予正對照組的12