Ascl12的RNA干擾通過microRNA-302b相關(guān)的途徑抑制結(jié)腸癌前體細(xì)胞生長(zhǎng).pdf

1、研究背景及目的：
　　 結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后不良，死亡率較高。結(jié)腸癌的治療一直是一大難題，結(jié)腸癌早期診斷率低，而中晚期結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移又使結(jié)腸癌的治療面臨著巨大的挑戰(zhàn)。腫瘤干細(xì)胞理論的提出給結(jié)腸癌的治療帶來了新的希望。該理論認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的種子細(xì)胞，在整個(gè)腫瘤細(xì)胞中僅占少數(shù)，但由于其具有無限增殖和不對(duì)稱分裂能力，是惡性腫瘤不斷生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。腫瘤干細(xì)胞是整個(gè)腫瘤

2、的種子和源泉，是腫瘤得以發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的“起始細(xì)胞”或“動(dòng)力細(xì)胞”，在整個(gè)腫瘤過程中起著至關(guān)重要的作用。目前研究認(rèn)為，結(jié)腸癌干細(xì)胞可能起源于正常成體腸隱窩干細(xì)胞。Asc12是一個(gè)堿性/螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，研究已證實(shí)其控制正常成體腸隱窩干細(xì)胞“命運(yùn)”。Asc12在小鼠腸上皮中的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)誘導(dǎo)了腸隱窩的過度增生和腸絨毛上的異位隱窩出現(xiàn)；Asc12基因在成體小鼠腸道的誘導(dǎo)缺失則導(dǎo)致Lgr5陽(yáng)性的成體腸隱窩干細(xì)胞在數(shù)天后消失。并且

3、，近來研究發(fā)現(xiàn)，Asc12在人結(jié)腸癌標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)。因此，我們?cè)O(shè)想，Asc12可能與結(jié)腸癌干/前體細(xì)胞相關(guān)。盡管如此，Asc12在結(jié)腸癌干/前體細(xì)胞中的作用尚未知。因此，我們選擇了人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞(CD133陽(yáng)性比例為47.5-95%)和LS174T細(xì)胞(CD133陽(yáng)性比例為0.45%)來對(duì)Asc12在結(jié)腸癌干/前體細(xì)胞中的作用進(jìn)行研究。
　　 研究方法及結(jié)果：
　　 免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)Asc12在結(jié)腸腺癌中表達(dá)

4、增高，而在正常結(jié)腸組織中表達(dá)僅限于隱窩基底。Asc12干擾后，HT-29和LS174T細(xì)胞的體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力均下降，同時(shí)干擾后的細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力也降低。Western-blot和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD133陽(yáng)性HT-29細(xì)胞中Asc12蛋白質(zhì)表達(dá)明顯高于CD133陰性HT-29細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Asc12干擾后，HT-29細(xì)胞中CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例由54.7%下降到26.2%。與干細(xì)胞“干性”相關(guān)的

5、基因CD133、Sox2、Oct4、Lgr5、Bmil和C-myc在Asc12干擾后HT-29和LS174T細(xì)胞出現(xiàn)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平下調(diào)(LS174T細(xì)胞由于流式檢測(cè)CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例極低未檢測(cè)CD133表達(dá)情況)，在兩株細(xì)胞的裸鼠移植瘤中檢測(cè)這些“干性”相關(guān)基因也得到一致的結(jié)果。同時(shí)，Asc12干擾后HT-29細(xì)胞的成球能力也下降，表現(xiàn)為所形成的腫瘤球大小和數(shù)目均減少。miRNA芯片篩選出26種miRNA在Asc12干擾后

6、HT-29細(xì)胞中出現(xiàn)2倍以上的表達(dá)上調(diào)，而58種miRNA在Asc12干擾后HT-29細(xì)胞中出現(xiàn)2倍以上的表達(dá)下調(diào)。與干細(xì)胞“干性”相關(guān)的let-7b、miRNA-124、miRNA-125b、miRNA-17、miRNA-20a和miRNA-302b也包括在其中，并且行qPCR驗(yàn)證進(jìn)一步證實(shí)了其表達(dá)差異。我們對(duì)這些miRNA進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用miRNA-302b mimics在Asc12干擾后的HT-29細(xì)胞中恢復(fù)了miRNA-3