RNA干擾沉默Survivin基因表達對結腸癌細胞的作用及蛋白質組學分析.pdf

1、大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在國內外都有較高的發(fā)病率。在美歐死亡率高居惡性腫瘤的第2位。我國已從第6位上升為第3位，。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和多種因素相關，其中細胞凋亡基因的突變起著重要作用。凋亡抑制蛋白家族（Inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）在抑制細胞凋亡中有重要作用。Survivm是近年發(fā)現(xiàn)的具有獨特結構的IAPs家族的成員，在惡性腫瘤中具有較高的表達水平，并且和腫瘤的臨床病理分期、淋巴節(jié)轉移等具

2、有密切的關系，是目前已知的最強的凋亡抑制因子。
　　 然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Survivin不僅參與凋亡的抑制，還影響腫瘤細胞的增殖、分裂以及轉移和侵襲等。但有關Survivin的研究觀點仍存在較多的分歧，如：有學者認為Survivin在細胞質中表達與腫瘤的治療效果和不良預后相關；而也有學者提出相反的觀點，在細胞質中分布提示腫瘤預后良好。有學者認為Survivin在G1/S期發(fā)揮作用，但也有認為調控G2/M期。因此Survi

3、vin作用機制復雜，需要從整體水平深入探討Survivin調控機制。
　　 蛋白質組學是在大規(guī)模水平上研究蛋白質變化的特征，通過觀察干預前后組織細胞水平蛋白質表達變化及差異，了解特定因素對腫瘤細胞的蛋白質表達影響，明確干預因素的作用機理。另外，RNA干擾（RNA interference，RNAi）是可誘導目的基因同源mRNA降解阻斷特定基因的表達，具有高度特異性和高效性。本研究應用RBAi技術，沉默Survivin基因的表達，

4、分析結腸癌細胞生物學特性的變化；提取RNAi前后的細胞總蛋白，采用蛋白質組學技術研究Survivin調控下的差異蛋白變化，尋找與Survivin功能相關的蛋白質。
　　 第一部分、 Survivin在結腸癌中的表達及分布
　　 目的：探討Survivin在結腸癌臨床標本和細胞株中的表達及分布。
　　 方法：采用免疫組織化學和免疫細胞化學的方法研究Survivin在結腸癌細胞中的表達水平及分布，明確Survivin

5、表達與腫瘤臨床特點的關系。
　　 結果：在結腸癌臨床組織標本中，Survivin陽性表達率為57.6％，結腸癌細胞株LoVo、HCT116、SW480中均有Survivin表達。Survivin以細胞質表達為主。Spearman相關分析顯示Survivin表達與腫瘤患者的臨床Ducks分期存在相關性。
　　 結論：在結腸癌臨床組織和細胞株中Survivin表達均較高，并以細胞質表達為主。Survivin與腫瘤的Ducks

6、分期具有相關性。
　　 第二部分、攜帶針對人Survivin的shRNA的腺病毒的轉染及對結腸癌細胞生物學特性的影響
　　 目的：研究Survivin基因對結腸癌細胞增殖、凋亡、周期和侵襲的影響。
　　 方法：擴增、純化攜帶針對人Survivm的shRNA的增殖缺陷型腺病毒，利用流式細胞技術、RT-PCR、Western-bolt等檢測對結腸癌細胞的感染及基因抑制效果。針對Survivin基因沉默后的結腸癌細胞，

7、采用流式細胞儀、MTT、單克隆平板、細胞侵襲實驗等，檢測Survivin基因在體外對細胞增殖、凋亡、細胞周期和侵襲的影響。另外研究Survivin基因體內對腫瘤生長的抑制作用。
　　 結果：增殖缺陷型腺病毒在MOI為50時，轉染率為92.67％，并具有明顯基因沉默作用。Survivin基因沉默后，凋亡率明顯增加，G1/S期細胞增多，G2/M期細胞減少，細胞侵襲能力減弱，Survivin在體內外均可抑制結腸癌細胞的生長。
　

8、　 結論：構建的增殖缺陷型腺病毒具有較高的轉染率和基因沉默高效性，Survivin對結腸癌細胞的凋亡、增殖、周期及侵襲有明顯的影響。
　　 第三部分、蛋白質樣品制備、雙向電泳及圖譜分析
　　 目的：探討RNAi后的蛋白質樣品制備、雙向電泳的條件及方法，為Survivin調控下差異蛋白的分析奠定基礎。
　　 方法：免疫熒光分析Survivin在SW480中的分布；采用液氮凍融，RNase、DNase酶解及超聲裂解

9、等方法獲取蛋白質樣品，在不同蛋白濃度和聚焦強度下進行雙向電泳，采用硝酸銀染色并對圖像進行分析。
　　 結果：在結腸癌細胞SW480中，Survivin主要分布在細胞質中。液氮凍融，RNase、DNase酶解及超聲裂解等處理可明顯降低核酸的影響，促進蛋白的溶解。250ug上樣量及70000Vh聚焦后，圖像分辨率和重復性均較好，在pI=4-8和Mr（15-120）×103分布的蛋白質點較多，蛋白質點數(shù)為1400個左右，超過80個蛋白

10、質點存在明顯差異。
　　 結論：成功建立了分辨率及重復性均較好的雙向電泳圖譜。
　　 第四部分、差異蛋白質的質譜鑒定及Survivin調控機制分析
　　 目的；對Survivin基因沉默前后的差異蛋白進行質譜分析，探討Survivin在結腸癌中的作用機制。
　　 方法：采用質譜分析及數(shù)據(jù)庫信息檢索，明確與Survivin相互作用蛋白質的變化；Western-bolt對興趣蛋白質進行表達驗證；免疫沉淀檢測與