白背飛虱10個(gè)轉(zhuǎn)氨酶基因的克隆與2個(gè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的功能驗(yàn)證.pdf

1、轉(zhuǎn)氨酶(Transaminase)是一種催化轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，將氨基酸的α-氨基轉(zhuǎn)移到一種α-酮酸上。白背飛虱長(zhǎng)期取食氨基酸營(yíng)養(yǎng)不平衡的植物韌皮部汁液卻仍能正常發(fā)育，有研究表明可能是其體內(nèi)共生菌為其提供必需氨基酸，從而保證了飛虱的營(yíng)養(yǎng)平衡。轉(zhuǎn)氨酶在氨基酸的代謝過(guò)程中起到重要的作用，也是昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的酶類。
　　本文搜索了重要的水稻害蟲(chóng)——白背飛虱的轉(zhuǎn)錄組中氨基酸代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)氨酶基因，采用RT-PCR、RACE技術(shù)獲得了

2、轉(zhuǎn)氨酶基因的cDNA全長(zhǎng);利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)氨酶基因的蛋白體外表達(dá)，通過(guò)測(cè)定轉(zhuǎn)氨酶的活性來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)氨酶基因的功能。研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　1.白背飛虱轉(zhuǎn)氨酶基因的克隆及密碼子偏性分析
　　基于白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)和RT-PCR技術(shù)，得到了編碼9類轉(zhuǎn)氨酶的20條片段序列，5類轉(zhuǎn)氨酶共7個(gè)基因來(lái)自共生菌，而其余4類轉(zhuǎn)氨酶中8個(gè)基因來(lái)自宿主昆蟲(chóng)，5個(gè)來(lái)自共生菌。應(yīng)用RACE技術(shù)獲得了2條丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、3條

3、犬尿氨酸α-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶、2條天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、1條支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、1條乙酰鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶和1條丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶的cDNA全長(zhǎng)。序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和密碼子偏好性分析結(jié)果進(jìn)行分析，推測(cè)支鏈氨基酸(Val、Leu、Ile)、精氨酸(Arg)、絲氨酸(Ser)、芳香族氨基酸（Tyr、Phe、Trp)的合成和分解過(guò)程中轉(zhuǎn)氨基作用由共生菌完成的，而丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸的代謝過(guò)程中轉(zhuǎn)氨基作用由宿主昆蟲(chóng)和共生菌協(xié)同完成。

4、　　2.白背飛虱丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因的序列分析及時(shí)空表達(dá)
　　序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，上章獲得的兩條ALTs均具有轉(zhuǎn)氨酶第Ⅰ亞家族的保守功能域，并含有保守的5'-磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn);同時(shí)，SfylsALT在白背飛虱各個(gè)發(fā)育時(shí)期均表達(dá)，并且在5齡若蟲(chóng)期出現(xiàn)表達(dá)高峰，在2齡若蟲(chóng)期表達(dá)量最低，其他時(shí)期的表達(dá)量比較一致;相反，SfALT1在性成熟的雄蟲(chóng)中表達(dá)量最高，其次是4齡若蟲(chóng)和1齡若蟲(chóng)，而在其他時(shí)期體內(nèi)的表達(dá)量較低。SfylsAL

5、T在白背飛虱腹部高表達(dá)，而SfALT1在頭、胸、腹、翅、足各部分廣泛表達(dá)。而SfylsBCAT1具有轉(zhuǎn)氨酶第Ⅲ亞家族的保守功能域，并且多肽結(jié)合位點(diǎn)、底物輔酶結(jié)合位點(diǎn)和活性位點(diǎn)的氨基酸殘基都保守。SfylsB CA T1在5齡若蟲(chóng)期表達(dá)量最高，2齡若蟲(chóng)期表達(dá)量最低，其他齡期的表達(dá)比較一致。
　　3.白背飛虱丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和支鏈氨基酸的真核表達(dá)及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶活性測(cè)定
　　為驗(yàn)證白背飛虱轉(zhuǎn)氨酶基因的功能，分別構(gòu)建2個(gè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基