白介素3(IL-3)依賴性小鼠骨髓細胞生成破骨細胞的體外培養(yǎng).pdf

1、目的：利用白介素3依賴性細胞（白介素3處理6天后的老鼠骨髓細胞）建立一種體外生成鼠類破骨細胞的方法。從小鼠骨髓細胞生成破骨細胞的體外培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)方法包括：利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法提純出單核細胞或者利用巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）處理老鼠全骨髓細胞2到3天以獲取巨噬細胞。盡管這些傳統(tǒng)的方法在體外準(zhǔn)備破骨細胞以研究破骨細胞的形成、功能、和存活方面的分子機制是足夠的，但是它們在解析控制破骨細胞前體分化和增殖的分子機制或

2、揭示早期破骨細胞的形成方面的研究上的作用不盡如人意。希望通過本研究解決傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)破骨細胞方法在研究上的缺陷。
　　方法：⑴從6到8周的C57BL/6小鼠股骨及脛骨上提取骨髓細胞，并在含有α-MEM（含10％小牛血清）培養(yǎng)基的100mm細胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)過夜以除去間質(zhì)細胞。然后，收獲不貼壁的骨髓細胞繼續(xù)在含10%小牛血清的α-MEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，一組不加白介素3（陰性對照），一組加1ng/ml的白介素3培養(yǎng)6天。6天后，陰性對照組

3、中的細胞大部分死亡，而白介素3處理過的細胞大部分仍然存活。并且，這些白介素3依賴性細胞在巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κ B受體活化因子配體（RANKL）的刺激下可以生成破骨細胞。同時，這些白介素3依賴性細胞在巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）的刺激下可繼續(xù)存活并增殖。4天的巨噬細胞集落刺激因子處理后的細胞可被EDTA消化，并且在巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κ B受體活化因子配體（RANKL）的刺激下分化成破骨

4、細胞。⑵對由白介素3依賴性小鼠骨髓細胞生成的破骨細胞進行體外蝕骨分析、半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT)-PCR、蛋白質(zhì)印跡分析、及感染小鼠骨髓細胞研究，以檢測此方法所生成的破骨細胞與傳統(tǒng)方法生成的破骨細胞有何區(qū)別。
　　結(jié)果：①白介素3可以維持老鼠骨髓細胞的存活高達6天，這些存活的細胞仍然保存分化成破骨細胞的能力。白介素3依賴性小鼠骨髓細胞形成破骨細胞的能力隨著白介素3處理天數(shù)的增加而減弱并且白介素3依賴性小鼠骨髓細胞在巨噬細胞

5、集落刺激因子的刺激下可進一步擴增的同時不影響形成破骨細胞的能力。②白介素3依賴性小鼠骨髓細胞可形成有功能的破骨細胞，這些破骨細胞還保持著骨吸收的能力。不僅如此，由白介素3依賴性小鼠骨髓細胞形成的破骨細胞表達所有的破骨細胞基因。核因子κ B受體活化因子配體可激活白介素3依賴性小鼠骨髓細胞RANK基因的某些信號旁路。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)這些白介素3依賴性細胞可被編碼綠色熒光蛋白(GFP)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
　　結(jié)論：⑴利用白介素3依賴