白介素3(IL-3)依賴性小鼠骨髓細(xì)胞生成破骨細(xì)胞的體外培養(yǎng).pdf

1、目的：利用白介素3依賴性細(xì)胞（白介素3處理6天后的老鼠骨髓細(xì)胞）建立一種體外生成鼠類破骨細(xì)胞的方法。從小鼠骨髓細(xì)胞生成破骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)方法包括：利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法提純出單核細(xì)胞或者利用巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）處理老鼠全骨髓細(xì)胞2到3天以獲取巨噬細(xì)胞。盡管這些傳統(tǒng)的方法在體外準(zhǔn)備破骨細(xì)胞以研究破骨細(xì)胞的形成、功能、和存活方面的分子機(jī)制是足夠的，但是它們在解析控制破骨細(xì)胞前體分化和增殖的分子機(jī)制或

2、揭示早期破骨細(xì)胞的形成方面的研究上的作用不盡如人意。希望通過本研究解決傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞方法在研究上的缺陷。
　　方法：⑴從6到8周的C57BL/6小鼠股骨及脛骨上提取骨髓細(xì)胞，并在含有α-MEM（含10％小牛血清）培養(yǎng)基的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)過夜以除去間質(zhì)細(xì)胞。然后，收獲不貼壁的骨髓細(xì)胞繼續(xù)在含10%小牛血清的α-MEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，一組不加白介素3（陰性對照），一組加1ng/ml的白介素3培養(yǎng)6天。6天后，陰性對照組

3、中的細(xì)胞大部分死亡，而白介素3處理過的細(xì)胞大部分仍然存活。并且，這些白介素3依賴性細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κ B受體活化因子配體（RANKL）的刺激下可以生成破骨細(xì)胞。同時，這些白介素3依賴性細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）的刺激下可繼續(xù)存活并增殖。4天的巨噬細(xì)胞集落刺激因子處理后的細(xì)胞可被EDTA消化，并且在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κ B受體活化因子配體（RANKL）的刺激下分化成破骨

4、細(xì)胞。⑵對由白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞生成的破骨細(xì)胞進(jìn)行體外蝕骨分析、半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT)-PCR、蛋白質(zhì)印跡分析、及感染小鼠骨髓細(xì)胞研究，以檢測此方法所生成的破骨細(xì)胞與傳統(tǒng)方法生成的破骨細(xì)胞有何區(qū)別。
　　結(jié)果：①白介素3可以維持老鼠骨髓細(xì)胞的存活高達(dá)6天，這些存活的細(xì)胞仍然保存分化成破骨細(xì)胞的能力。白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的能力隨著白介素3處理天數(shù)的增加而減弱并且白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞在巨噬細(xì)胞

5、集落刺激因子的刺激下可進(jìn)一步擴(kuò)增的同時不影響形成破骨細(xì)胞的能力。②白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞可形成有功能的破骨細(xì)胞，這些破骨細(xì)胞還保持著骨吸收的能力。不僅如此，由白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞形成的破骨細(xì)胞表達(dá)所有的破骨細(xì)胞基因。核因子κ B受體活化因子配體可激活白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞RANK基因的某些信號旁路。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)這些白介素3依賴性細(xì)胞可被編碼綠色熒光蛋白(GFP)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
　　結(jié)論：⑴利用白介素3依賴