毛裂蜂斗菜中蜂斗菜總內(nèi)酯的制備及生物活性研究.pdf

1、毛裂蜂斗菜(Petasites tricholobus Franch．)是菊科蜂斗菜屬植物，廣泛分布于西南、西北地區(qū)，其根莖民間用于解毒祛瘀，外敷治跌打損傷、骨折蛇傷等，其花蕾在中國(guó)西北地區(qū)作為款冬花的替代品用于止咳、平喘。 研究背景：蜂斗菜屬植物歐蜂斗菜(Petasites hybridus)作為植物藥，在歐洲已經(jīng)有幾百年的應(yīng)用歷史。其根莖的二氧化碳提取物用于治療偏頭疼，泌尿生殖道痙攣，哮喘，過(guò)敏性鼻炎等。倍半萜類(lèi)化合物被認(rèn)為

2、是其主要有效成分，現(xiàn)代藥理研究表明，蜂斗菜素(petasin)和硫蜂斗菜素(S-petasin)等倍半萜類(lèi)化合物具有抗組胺，抑制白三烯合成，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的作用，從而達(dá)到抗炎、解痙的藥效。倍半萜內(nèi)酯類(lèi)化合物，初步的體外藥理實(shí)驗(yàn)表明，這類(lèi)化合物有細(xì)胞毒性，具有潛在的抗癌活性，并且可抑制血小板活化因子，達(dá)到抗凝的作用。為了開(kāi)發(fā)我國(guó)蜂斗菜屬植物資源，本課題組在前期對(duì)其同屬植物毛裂蜂斗菜(Petasites tricholobus Fra

3、nch．)的化學(xué)成分進(jìn)行了較為系統(tǒng)性的研究，從毛裂蜂斗菜根莖中分離得到倍半萜內(nèi)酯類(lèi)化合物蜂斗菜內(nèi)酯D、蜂斗菜內(nèi)酯B以及蜂斗菜內(nèi)酯Ⅰa(1)，蜂斗菜內(nèi)酯Ⅱ a(2)，蜂斗菜內(nèi)酯Ⅲa(3)，蜂斗菜內(nèi)酯Ⅳa(4)，蜂斗菜內(nèi)酯Ⅴa(5)5個(gè)倍半萜類(lèi)新化合物，以及考察了蜂斗菜內(nèi)酯Ⅰa-Ⅴa對(duì)缺氧-復(fù)氧造成的神經(jīng)元損傷及氧化性損傷的保護(hù)作用，本研究在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步對(duì)其內(nèi)酯類(lèi)化學(xué)成分進(jìn)行生物活性研究。 研究目的：通過(guò)對(duì)毛裂蜂斗菜中總內(nèi)酯的

4、制備以及生物活性研究，明確其藥理活性，并對(duì)其藥效機(jī)理進(jìn)行深入的探討，為毛裂蜂斗菜資源的開(kāi)發(fā)利用以及新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。 研究?jī)?nèi)容和方法： 樣品的采集：毛裂蜂斗菜采自四川成都。 1．毛裂蜂斗菜中蜂斗菜總內(nèi)酯的制備以及含量的HPLC測(cè)定：將毛裂蜂斗菜用95％乙醇滲漉提取，提取液濃縮至無(wú)乙醇味、冷卻，上大孔樹(shù)脂，依次用60％、80％、95％乙醇洗脫，然后將80％乙醇洗脫液減壓濃縮至干，可得蜂斗菜總內(nèi)酯。應(yīng)用HPLC測(cè)定

5、蜂斗菜總內(nèi)酯B、D、Ⅳa、Ⅲa的含量。 2．蜂斗菜總內(nèi)酯過(guò)敏性鼻炎的藥效學(xué)研究。首先對(duì)豚鼠以卵清白蛋白(OVA)抗原攻擊，依次基礎(chǔ)致敏、致敏加強(qiáng)和激發(fā)三個(gè)階段成功的建立了過(guò)敏性鼻炎(AR)的模型，成功率100％，然后給予蜂斗菜總內(nèi)酯40mg/kg連續(xù)7天，初步證實(shí)了蜂斗菜總內(nèi)酯的抗過(guò)敏性鼻炎活性。然后對(duì)Wistar大鼠同樣以卵清白蛋白(OVA)抗原攻擊，依次基礎(chǔ)致敏、致敏加強(qiáng)和激發(fā)三個(gè)階段成功的建立了大鼠過(guò)敏性鼻炎的模型，成功率

6、82.7％，并首次用ELISA實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了過(guò)敏Wistar大鼠血清中總IgE的效價(jià)，進(jìn)一步佐證模型的成功，然后分別給予蜂斗菜總內(nèi)酯40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg以及氯雷他定0.942mg/kg連續(xù)7天，結(jié)果表明蜂斗菜總內(nèi)酯各個(gè)劑量和氯雷他定均能不同程度的減輕抗原誘導(dǎo)的大鼠過(guò)敏性鼻炎的癥狀，并通過(guò)對(duì)大鼠鼻粘膜病理組織學(xué)檢查來(lái)觀(guān)察浸潤(rùn)的嗜酸性淋巴細(xì)胞的數(shù)目的變化。 3．蜂斗菜總內(nèi)酯治療過(guò)敏性鼻炎的機(jī)理探討

7、。用ELISA實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定血清中IL-4以及組胺的含量。 4．蜂斗菜總內(nèi)酯體內(nèi)對(duì)二甲苯致ICR小鼠耳腫脹的影響。蜂斗菜總內(nèi)酯40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg和5mg/kg對(duì)ICR小鼠灌胃連續(xù)給藥7天，末次給藥后45min，右耳涂以50μl二甲苯致炎，15min后將小鼠頸脫臼致死，用內(nèi)徑7mm的打孔器打下相同部位左右耳片，稱(chēng)重，以?xún)啥亓恐钭鳛槟[脹度。以此為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)觀(guān)察蜂斗菜總內(nèi)酯的抑制炎性水腫的作用。 5

8、．蜂斗菜總內(nèi)酯體內(nèi)外抗腫瘤活性研究。依次用蜂斗菜總內(nèi)酯160、80、40、20、10、5、2.5、1.25ug/ml對(duì)HePG2、MCF-7、A549、Hela腫瘤細(xì)胞體外MTT實(shí)驗(yàn)以及ICR小鼠體內(nèi)S180腫瘤實(shí)驗(yàn)，在接種第二天分別給予蜂斗菜總內(nèi)脂160mg/kg、80mg/kg、40mg/kg連續(xù)給藥14天，第16天眼眶取血、脫頸處死剝離腫瘤、并取脾臟和胸腺稱(chēng)重記錄。 結(jié)果和結(jié)論：蜂斗菜總內(nèi)酯減少過(guò)敏性大鼠搔鼻、噴嚏次數(shù)以及

9、減輕鼻涕癥狀，并能有效減少鼻粘膜中嗜酸性淋巴細(xì)胞數(shù)目，ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它還能顯著降低血清中IL-4和Histamine含量，故而推斷毛裂蜂斗菜總內(nèi)酯抗過(guò)敏性鼻炎的機(jī)制是通過(guò)抑制IL-4使特異性抗體IgE降低，阻斷AR癥狀的主要炎性介質(zhì)組胺作用于H1受體的過(guò)程，具有與H1受體拮抗劑相似的藥理作用，從而達(dá)到緩解鼻炎癥狀的目的；蜂斗菜總內(nèi)酯能夠有效降低毛細(xì)血管通透性，具備一定的抑制炎性水腫的作用。本研究結(jié)果為蜂斗菜總內(nèi)酯的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定