水稻OsGLO5和OsCATA基因?qū)夂粑x的影響.pdf

1、光呼吸途徑是植物體內(nèi)重要的碳素代謝途徑，也是重要的能量代謝途徑。光呼吸代謝通過消耗光合作用中間產(chǎn)物、影響植物體內(nèi)氮素代謝或積累光呼吸途徑中間產(chǎn)物等抑制光合作用，降低卡爾文循環(huán)固定CO2的量。通過抑制光系統(tǒng)D1蛋白的合成阻止PSII損傷的修復(fù)，同時由于光呼吸代謝可以影響光合作用固定CO2的量，從而引起光能的吸收和利用之間的失衡，過多的光能使光系統(tǒng)產(chǎn)生過量的活性氧影響光呼吸和光系統(tǒng)。光呼吸途徑在過氧化物酶體中產(chǎn)生的H2O2，不僅具有細(xì)胞毒性

2、，同時也是細(xì)胞內(nèi)的氧化還原信號，甚至能引起細(xì)胞的程序性死亡。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建水稻光呼吸途徑OsGLO5基因干擾載體轉(zhuǎn)化水稻，分析OsGLO5基因?qū)夂粑x、卡爾文循環(huán)、光系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的影響;利用OsCATAi轉(zhuǎn)基因水稻分析OsCATA基因?qū)夂粑x、卡爾文循環(huán)、光系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的影響;通過改變CO2和O2的比例，分析不同濃度CO2和O2處理對光呼吸代謝、卡爾文循環(huán)、光系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明:
　　1.從水稻cDNA中

3、擴(kuò)增出OsGLO5基因一段404 bp的序列用于構(gòu)建干擾載體，測序結(jié)果與水稻數(shù)據(jù)庫中的序列同源性100％，該段序列跨OsGLO5基因第2、3、4、5、6和7共六個外顯子，其中第2和第7外顯子只含有一段序列。構(gòu)建了UBi-1啟動子調(diào)控的OsGLO5基因干擾載體，該載體含有由35S啟動子控制的GUS基因和潮霉素基因。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將OsGLO5i載體和不帶有干擾片段的空載體轉(zhuǎn)化日本晴。
　　2.通過GUS染色、提取DNA、定量P

4、CR、Western blot和酶活性測定等鑒定和分析轉(zhuǎn)基因水稻，GUS染色鑒定和提取T2代水稻DNA并進(jìn)行PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因水稻純合株系，共獲得轉(zhuǎn)空載體水稻一個株系，OsGLO5i轉(zhuǎn)基因水稻兩個株系。與日本晴相比OsGLO5i轉(zhuǎn)基因水稻定量PCR分析顯示OsGLO5基因表達(dá)下降到20％和17％;Western blot分析顯示OsGLO蛋白含量下降到61％和67％，GLO活性下降到54％和48％。同時OsGLO1、OsGLO2和O

5、sGLO3基因表達(dá)量也出現(xiàn)顯著下調(diào)的變化， OsGLO4基因表達(dá)差異不顯著。轉(zhuǎn)基因水稻株高變矮、葉長變短。與日本晴相比，OsCATAi轉(zhuǎn)基因水稻定量PCR分析顯示OsCATA基因表達(dá)下降到28％和15％;Western blot分析顯示OsCATA蛋白含量降低到不能被檢測出，CAT活性下降到7％和6％。同時OsCATC基因表達(dá)顯著增加，達(dá)到750％和816％，OsCATB基因表達(dá)未出現(xiàn)顯著性變化。轉(zhuǎn)基因水稻株高變矮，葉片出現(xiàn)白色病斑，花

6、期延遲5-10天。
　　3.OsGLO5i轉(zhuǎn)基因水稻光飽和點(diǎn)和CO2飽和點(diǎn)下降，且400μmol·mol-1 CO2濃度和800μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下凈光合速率略有下降，表達(dá)分析顯示編碼C2途徑相關(guān)酶基因OsHPR和OsGDC表達(dá)下降，Rubisco活性顯著下降，編碼C3途徑相關(guān)酶基因OsrbcL、OsRPI和OsFBA表達(dá)也顯著下降。葉綠素?zé)晒鈪?shù)、編碼光系統(tǒng)蛋白基因表達(dá)、抗氧化酶活性和編碼抗氧化酶基因表達(dá)等與日本晴

7、和轉(zhuǎn)空載體水稻相比差異不顯著，抗氧化物質(zhì)ASC含量、DHA含量、GSH含量和GSSG含量在不同株系中出現(xiàn)顯著增加的變化。田間農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)顯示，穗長、粒寬和百粒重均出現(xiàn)顯著下降的變化，單株產(chǎn)量在部分株系也出現(xiàn)了顯著性下降，粒長和穗數(shù)變化不顯著。
　　4.OsCATAi轉(zhuǎn)基因水稻光飽和點(diǎn)和CO2飽和點(diǎn)顯著下降，且400μmol·mol-1 CO2濃度和800μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下凈光合速率顯著下降，表達(dá)分析顯示編碼C2和C

8、3途徑相關(guān)酶基因OsFBA、OsrbcL、OsRPI、OsHPR和OsGDC表達(dá)量下降，Rubisco初始活性和總活性顯著下降。葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、qN、qP和Yield均出現(xiàn)下降的變化，編碼光系統(tǒng)蛋白基因OsPsb H、OsPsb R和OsLHC表達(dá)量也出現(xiàn)顯著下降的變化。抗氧化酶SOD活性、APX活性、GPX活性和GR活性等顯著增加，且編碼抗氧化酶基因OsSOD、OsAPX、OsGPX和OsGR表達(dá)也出現(xiàn)增加的變化，抗氧化物質(zhì)

9、ASC含量、DHA含量、GSH含量和GSSG含量等也顯著增加，H2O2含量也表現(xiàn)出顯著增加，但是并沒有出現(xiàn)成倍增加的變化。
　　5.不同濃度CO2和O2處理下，OsGLO5i轉(zhuǎn)基因水稻和日本晴的數(shù)字基因表達(dá)譜分析結(jié)果表明，與正常空氣中相比日本晴在高CO2處理下分別有451個基因表達(dá)上調(diào)，496個基因表達(dá)下調(diào);在低O2處理下有282個基因表達(dá)上調(diào)，397個基因表達(dá)下調(diào);在高O2處理下有445個基因表達(dá)上調(diào)，564個基因表達(dá)下調(diào)。與正

10、常空氣中日本晴相比OsGLO5i轉(zhuǎn)基因水稻有763個基因表達(dá)上調(diào)，191個基因表達(dá)下調(diào)，在不同濃度CO2和O2處理下上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)分別為:1272∶289（高CO2處理）、1337∶885（低O2處理）和1505∶727（高O2處理）。
　　6.與正?？諝庵邢啾?，日本晴在高CO2處理下，Rubisco初始活性和總活性降低，GLO活性降低，凈光合速率和總光合速率均出現(xiàn)下降的變化，編碼C2和C3途徑相關(guān)酶基因OsrbcL、OsRP

11、I、OsGLO5、OsHPR和OsGDC等均出現(xiàn)下調(diào)的變化。葉綠素?zé)晒鈪?shù)qP和Yield也表現(xiàn)出下降的變化?？寡趸窩AT活性則出現(xiàn)下降的變化，GSH含量和GSSG含量也表現(xiàn)出下降的變化。在低O2處理下，日本晴的生理和分子上的變化和在高CO2處理下相似，Rubisco初始活性和總活性降低，GLO活性降低，凈光合速率和總光合速率均出現(xiàn)下降的變化，但是均比高CO2處理下要高。葉綠素?zé)晒鈪?shù)qP、Yield和抗氧化酶活性的變化也表現(xiàn)出與高C

12、O2處理下相同的變化趨勢。在高O2處理下，日本晴的生理和分子上的變化與正?？諝庵胁町愝^小，Rubisco活性、GLO活性、凈光合速率、總光合速率、葉綠素?zé)晒鈪?shù)qP、Yield、抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量等與高CO2處理相比，基本表現(xiàn)出增加的變化。
　　7.與日本晴和轉(zhuǎn)空載體水稻相比，OsGLO5i轉(zhuǎn)基因水稻在不同氣體處理下，GLO活性和總光合速率均顯著降低;在高O2處理下Rubisco初始活性和總活性均顯著下降，凈光合速率、q

13、N、qP和Yield等也顯著下降，且編碼相關(guān)代謝途徑基因表達(dá)分析結(jié)果也表現(xiàn)出下降的變化;抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量在不同氣體下均未出現(xiàn)顯著的一致性變化。在高CO2和低O2處理下，OsGLO5i轉(zhuǎn)基因水稻與日本晴和轉(zhuǎn)空載體水稻相比差異較小。
　　綜上所述，OsGLO5i轉(zhuǎn)基因水稻和OsCA TAi轉(zhuǎn)基因水稻田間結(jié)果，和不同濃度CO2和O2處理結(jié)果表明，光呼吸代謝對卡爾文循環(huán)有反饋?zhàn)饔?，?dāng)光呼吸降低超過一定范圍時，卡爾文循環(huán)固定的C