兩株DENV-2E蛋白N端158氨基酸基序與DC相互作用的研究.pdf

1、目的:
　　通過構(gòu)建2型登革病毒臨床分離株（DENV-2 B株）和國際參考株（DENV-2 NGC株）E基因區(qū)部分序列的原核表達(dá)載體，進(jìn)行蛋白表達(dá)、復(fù)性和純化，制備特異性多克隆抗體，并研究表達(dá)蛋白與DC的相互作用。
　　方法:
　　分別將B株和NGC株E基因1-476bp序列克隆入原核表達(dá)載體pET28a(+)載體，分別命名為pET28a(+)/B-E，pET28a(+)/NGC-E。酶切、測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌Ro

2、setta，IPTG誘導(dǎo)后將包涵體變性，復(fù)性，純化;用純化蛋白免疫C57BL/6和BALB/c小鼠制備多克隆抗體，并通過western blot和間接ELISA法鑒定抗體。對(duì)經(jīng)蛋白免疫3周后的C57BL/6小鼠注射病毒，檢測小鼠血清抗巨蛋白特異性IgG類抗體滴度。將兩種蛋白分別與人外周血新鮮分離誘導(dǎo)的DC共孵育48小時(shí)，比較兩種蛋白與DC的結(jié)合情況、DC表型的變化和IL-12的分泌。
　　結(jié)果:
　　1、構(gòu)建pET28a(+

3、)-B-E/pET28a(+)-NGC-E原核表達(dá)重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切，PCR，測序鑒定，挑選含有正確序列的重組質(zhì)粒。
　　2、將pET28a(+)-B-E/pET28a(+)-NGC-E轉(zhuǎn)入Rosetta菌表達(dá)E蛋白，E基因區(qū)DomainⅠ序列獲得高效表達(dá)，相對(duì)分子量約20kDa;Western-blot結(jié)果表明目的蛋白的His標(biāo)簽可與抗His標(biāo)簽的單克隆抗體結(jié)合，進(jìn)一步驗(yàn)證目的蛋白為外源表達(dá)的E蛋白。對(duì)蛋白進(jìn)行變性、復(fù)性，用Ni柱

4、親和層析法純化蛋白，得到的E蛋白純度高于90％。
　　3、將純化后的E蛋白免疫BALB/c和C57BL/6小鼠分別獲得特異性多克隆抗體，間接ELISA法檢測C57BL/6小鼠抗E蛋白特異性IgG類抗體滴度為1∶12800，Western-blot檢測BALB/c小鼠特異性IgG類抗體滴度大于1∶500，并可用于FACS檢測。
　　4、用兩種蛋白免疫C57BL/6小鼠3周后腹腔注射DENV-2 NGC株病毒，發(fā)現(xiàn)注射病毒后0-

5、72小時(shí)NGC-E蛋白免疫的小鼠產(chǎn)生的抗E蛋白特異性IgG類抗體水平較高，但第6天時(shí)B-E蛋白免疫小鼠產(chǎn)生特異性IgG類抗體水平高于NGC-E蛋白免疫小鼠。
　　5、用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)人外周血PBMC，7天后得到純度高于90％的未成熟DC。
　　6、通過流式細(xì)胞法，激光共聚焦顯微鏡觀察到PBMC來源的DC可以有效的與兩種E蛋白結(jié)合，NGC-E與DC的結(jié)合率較高;并觀察到，作用48小時(shí)NGC-E可使DC表面CD80，

6、CD83，CD86，HLA-DR，CD11c表達(dá)增加;雙抗體夾心ELISA法檢測表明，NGC-E可以使DC分泌大量IL-12;相同時(shí)間內(nèi)B-E不能誘導(dǎo)DC成熟。
　　結(jié)論:
　　1.pET28a(+)-B-E/pET28a(+)-NGC-E轉(zhuǎn)入Rosetta菌表達(dá)E蛋白，得到復(fù)性蛋白純度高于90％，相對(duì)分子量約20kDa;
　　2.B-E對(duì)BALB/c和C57BL/6小鼠均具有免疫原性?？纱碳ば∈螽a(chǎn)生特異性抗體;并可用