白細胞介素6及下游JAK-STAT3信號通路在前列腺相關疾病中的作用及機制研究.pdf

1、【研究背景】
　　白細胞介素6（IL-6）是一種多功能細胞因子。研究發(fā)現：IL-6可能參與慢性前列腺炎的病理過程；同時在前列腺癌激素非依賴性形成以及神經內分泌化過程中，IL-6仍可能發(fā)揮著重要作用。然而在這兩類疾病中，IL-6的具體作用機制仍不清楚。目前為止，仍缺乏在慢性前列腺炎中關于IL-6的分子流行病學研究；同時對于IL-6及其下游信號在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機制，仍需深入探索。
　　【目的】
　　1.針對

2、Ⅲ型慢性前列腺炎，在蛋白質表達及基因多態(tài)性層面上，對IL-6進行分子流行病學調查；2.研究IL-6及下游JAK/STAT3信號途徑對前列腺癌細胞系生物學行為的影響；3.在前列腺癌細胞系中，建立靶向沉默JAK/STAT3信號途徑的RNA干涉體系；4.分析JAK/STAT3信號途徑靶向沉默后，前列腺癌細胞系生物學行為的改變及可能機制。
　　【方法】
　　1.采用流行病學調查方法，選定IL-6分子流行病學研究的基線人群，結合環(huán)境因

3、子及癥狀差異進一步建立分組研究隊列；2.以初次的NIH-CPSI（NationalInstitutesofHealthchronicprostatitissymptomindex，美國國立衛(wèi)生研究院慢性前列腺炎癥狀評分）問卷調查及二次臨床篩查為病例納入方式，篩選Ⅲ型慢性前列腺炎患者并按亞型進一步分組，系統(tǒng)分析IL-6與癥狀、其他炎癥因子及氧化應激水平的關系；3.酶聯免疫吸附法測定血清及EPS（Expressedprostaticsecr

4、etion，前列腺液）中IL-6等細胞因子水平，并分析炎癥因子的相互關系；4.利用DCFH2-DA（2',7'-二氯二氫熒光素二乙酯，2′,7′-dichlorofluorescindiacetate）測定EPS中ROS（reactiveoxygenspecies，活性氧）水平增長率，并分析ROS與IL-6水平的關系；5.采用ABTS（2,2'-Azinobis3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicAcidA

5、mmoniumSalt，2,2'-聯氮雙3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽）比色法測定EPS中TAOC（Totalantioxidantcapacity，總抗氧化能力）相對水平，并分析TAOC與IL-6水平的關系；6.四聚體ARMS-PCR（Amplificationrefractorymutationsystempolymerasechainreaction，擴增受阻突變體系聚合酶鏈反應）檢測IL-6分子啟動子區(qū)-174G/C基因型，

6、并分析與EPS中IL-6水平與癥狀的關系；7.分子生物學方法構建PSMA（Prostatespecificmembraneantigen，前列腺特異性膜抗原）特異性單鏈抗體融合蛋白并鑒定其活性；8.利用分子生物學軟件，設計STAT3（Signaltransducerandactivator3，信號轉導和激活因子3）特異性siRNA（SmallinterferingRNA，小干擾RNA），并通過流式細胞儀分析及細胞ELISA（Enzyme

7、linkedimmunosorbentassay，酶聯免疫吸附法）方法鑒定PSMA單鏈抗體融合蛋白對其的靶向遞送能力；9.利用IL-6對前列腺癌LNCaP細胞系的雙重生物學作用，建立IL-6處理的前列腺癌細胞系研究模型；10.利用STAT3的特異性siRNA處理LNCaP細胞，WesternBlot方法檢測相關STAT3分子的表達；11.利用MTT[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-dipheny

8、tetrazoliumromide，噻唑藍]方法描繪細胞進行生長曲線；12.采用PI（Propidiumiodide，碘化丙啶）染色流式細胞術檢測處理細胞的周期的變化，用AnnexinV（膜聯蛋白-V）/PI雙染色流式細胞術檢測凋亡。
　　【結果】
　　1.III型慢性前列腺炎IL-6分子流行病學研究
　　1)各亞型CP/CPPS患者EPS中IL-6水平，較對照組均明顯增高，但不伴有血清IL-6的變化。
　　2)

9、在IIIa亞型癥狀加重的病理過程中，IL-6與TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10共同參與其病理進程，并伴有氧化應激水平的增高及抗氧化能力的下降。
　　3)IL-6參與IIIb亞型的病理進程，在IIIb亞型癥狀加重的過程中未發(fā)現TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10及氧化應激水平的明顯變化。
　　4)盡管對于CP/CPPS鏡檢分型標準的意義存在爭議，但依據此標準的研究發(fā)現，IL-6在兩型CP/CPPS中參與的病理機

10、制可能不同。
　　5)IL-6啟動子-174C/G基因型的CP/CPPS患者伴有較高水平的EPS-IL-6，同時其癥狀分值明顯高于GG、CC純合子患者。
　　2.外源性IL-6對前列腺癌細胞系生物學行為的影響及其下游信號傳導研究
　　1)在外源性IL-6處理LNCaP細胞的初期，IL-6具有明顯的促細胞凋亡，阻滯細胞周期及抑制增殖的作用。
　　2)在IL-6抑制LNCaP細胞增殖階段，同時也導致LNCaP細胞分泌

11、PSA水平的增高。
　　3)在IL-6誘導PSA的信號傳導途徑中，STAT3發(fā)揮了重要作用，因為STAT3被靶向沉默后，隨著磷酸化STAT3的減少，PSA的分泌水平出現明顯降低。
　　4)STAT3并沒有參與IL-6對LNCaP細胞增殖的抑制過程，因為在STAT3沉默后沒有觀察到IL-6處理LNCaP細胞生長曲線的變化，這表明：IL-6對LNCaP細胞的增殖抑制是通過其他信號傳導途徑來完成。
　　【結論】
　　1