組織培養(yǎng)法保存軟骨移植移植物體積對軟骨細(xì)胞存活率及力學(xué)性質(zhì)的影響.pdf

1、目的：
　　通過在體外組織培養(yǎng)液中保存不同體積大小的羊膝關(guān)節(jié)軟骨一定時(shí)間后比較其軟骨細(xì)胞存活率及生物力學(xué)性質(zhì)差異，并且觀察新型組織培養(yǎng)液TSMU-1液對軟骨細(xì)胞存活率的影響，為進(jìn)一步尋找最佳的骨軟骨移植物保存方式及保存液提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法：
　　以羊膝關(guān)節(jié)軟骨為實(shí)驗(yàn)材料，無菌條件下用ARTHREX骨軟骨移植器械在羊膝關(guān)節(jié)股骨髁關(guān)節(jié)面內(nèi)外側(cè)負(fù)重區(qū)獲取圓柱狀骨軟骨塊100枚，包括軟骨下骨全長約10mm，直

2、徑約為6mm，PBS液沖洗3遍備用。將骨軟骨塊隨機(jī)分為2組（每組各50枚），即兩個(gè)不同培養(yǎng)液成分的無菌培養(yǎng)瓶中進(jìn)行保存。A1組: TSMU-1液（泰山醫(yī)學(xué)院1號軟骨保存液），TSMU-1液具體成分為基礎(chǔ)保存液中添加部分改善細(xì)胞活性的因子（具體配置方法及成份正在申請專利）;B1組:基礎(chǔ)保存液?；A(chǔ)保存液成份為99％EMEM培養(yǎng)液和1％的青鏈霉素（各100UI/ml）。在4℃、每隔兩天換液的條件下，于保存第1天、35天每瓶隨機(jī)各取出20塊進(jìn)

3、行檢測軟骨細(xì)胞存活率（EB/FDA雙熒光法）。第35天A1組取出10枚標(biāo)本，以特制骨刀切取軟骨試樣標(biāo)本加工成長度6mm，寬度4mm，厚度2-3mm的試樣，在日本島津AG-10TA自動(dòng)控制電子萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)上對10個(gè)軟骨試樣進(jìn)行一維拉伸實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)機(jī)的拉伸實(shí)驗(yàn)速度為5 mm/min。主要觀察試件拉伸最大載荷、最大位移、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變等力學(xué)指標(biāo)。
　　無菌條件下，用消毒鋼鋸切取羊股骨髁半髁關(guān)節(jié)面(包括軟骨下骨約10mm)20個(gè)，隨機(jī)分2

4、組（每組各10個(gè)），同樣分配至以上A、B兩種保存液中保存，并標(biāo)記為A2組（TSMU-1液+半股骨髁關(guān)節(jié)面），B2組（基礎(chǔ)保存液+半股骨髁關(guān)節(jié)面組）。同樣條件下，再切取完整的羊股骨髁關(guān)節(jié)面（包括軟骨下骨約10mm）20個(gè)，分組及保存方式同上，標(biāo)記為A3組（TSMU-1液+完整股骨髁關(guān)節(jié)面組），B3組（基礎(chǔ)保存液+完整股骨髁關(guān)節(jié)面組）。保存第1天、35天，無菌條件下用ARTHREX骨軟骨移植器械在不同種類保存液中的全髁和半髁關(guān)節(jié)面負(fù)重區(qū)隨機(jī)

5、獲取直徑約為6mm的圓柱狀骨軟骨塊，每組每次各20枚，檢測軟骨細(xì)胞存活率。保存第35天時(shí)，A2組和A3組再隨機(jī)各取10枚圓柱狀骨軟骨塊，同樣加工成長度6mm，寬度4mm，厚度2-3mm的試樣，與A1組共同進(jìn)行一維拉伸力學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)。拉伸實(shí)驗(yàn)速度為5mm/min。觀察試件拉伸最大載荷、最大位移、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變等力學(xué)指標(biāo)。
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有數(shù)據(jù)均用(x)±s表示。對各個(gè)保存組及每組不同時(shí)間點(diǎn)之間

6、細(xì)胞存活率采用重復(fù)測定數(shù)據(jù)的方差分析，然后對具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的處理因素（A因素即不同營養(yǎng)液，35天;B因素指同一種營養(yǎng)液不同的軟骨保存體積，35天），分別進(jìn)行單因素方差分析q檢驗(yàn)（S-N-K法）。一維拉仲力學(xué)性能指標(biāo)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析q檢驗(yàn)。P＜0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　第1天時(shí)各組軟細(xì)胞成活率均保持在90％以上，各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。第35天時(shí)，骨軟骨塊各組中軟骨細(xì)胞成活

7、率均出現(xiàn)降低。A液(TSMU-1液)各組比較，A1組＞A2組，A1組＞A3組，A2組＞A3組，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。B液（基礎(chǔ)保存液）各組之間比較，B1組＞B2組，B1組＞B3組，B2組＞B3組。結(jié)果是同種保存液里，柱狀軟骨塊保存效果最佳，半髁關(guān)節(jié)面組好于全髁關(guān)節(jié)面組
　　A、B兩種保存液之間比較，可見A1組＞B1組，A2組＞B2組，A3組＞B3組。各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。表明A液(TSMU-

8、1液)好于B液（基礎(chǔ)保存液）
　　A液各組中一維拉伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最大載荷、最大位移、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變等生物力學(xué)數(shù)據(jù)為A1組＞A2組，A1組＞A3組，A2組＞A3組。柱狀軟骨塊的軟骨拉伸力學(xué)性能保持的最好，半髁關(guān)節(jié)面組好于全髁關(guān)節(jié)面組。
　　結(jié)論：
　　體外組織培養(yǎng)中骨軟骨移植物的體積大小對其軟骨的細(xì)胞存活率及生物力學(xué)有一定影響，體積較小的骨軟骨移植物軟骨細(xì)胞存活率更高，力學(xué)性質(zhì)更好。另外，新型骨軟骨組織培養(yǎng)液TSM

9、U-1液能夠有效提高體外液體保存的骨軟骨移植物的軟骨細(xì)胞存活率。
　　意義：
　　關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)方法一直是困惑運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)及骨科醫(yī)生的難題。目前在臨床上用新鮮的同種異體骨軟骨移植治療全層軟骨損傷取得了一定的效果，但由于新鮮異體軟骨的取材受到許多方面的限制，影響了異體骨軟骨移植的臨床應(yīng)用與推廣。因此，延長骨軟骨移植物的體外保存時(shí)間并保持其活性成為學(xué)者研究的焦點(diǎn)。本課題研究發(fā)現(xiàn)體外組織培養(yǎng)法中較小的骨軟骨移植物與大塊移植物比較有