不同保存方法對(duì)豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率及代謝活性的影響.pdf

1、目的：通過(guò)組織培養(yǎng)法、慢速梯度降溫保存法和傳統(tǒng)慢速連續(xù)降溫保存法處理離體骨軟骨，以新鮮骨軟骨組作為對(duì)照，比較三種不同方法對(duì)關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)、軟骨細(xì)胞存活率及代謝活性的不同影響。通過(guò)比較研究篩選出保存效果較好的方法，為臨床提供一種有活性的異體軟骨移植物。 方法：取3月齡同種系本地豬10只20膝關(guān)節(jié)。將供體豬處死后，無(wú)菌條件下在髕股關(guān)節(jié)及脛股關(guān)節(jié)切取正常骨軟骨，制成直徑約4.5mm、全長(zhǎng)約5mm的圓柱形骨軟骨塊240枚。將骨軟骨塊隨

2、機(jī)分為4組，每組60枚。分別為對(duì)照組、組織培養(yǎng)組、慢速梯度降溫冷凍保存組、慢速連續(xù)降溫冷凍保存組。對(duì)照組不采取任何處理措施，半小時(shí)內(nèi)直接取材檢測(cè)軟骨細(xì)胞存活率及代謝活性。慢速連續(xù)降溫冷凍保存組采取目前文獻(xiàn)報(bào)道的程序冷凍法處理保存；慢速梯度降溫冷凍保存組是把標(biāo)本溫度降至－40℃以前分4個(gè)梯度降溫的保存方法；組織培養(yǎng)組將骨軟骨塊按體積比1：15放入配制的無(wú)菌RPMI1640培養(yǎng)液中37℃保存。各實(shí)驗(yàn)組軟骨標(biāo)本于保存2、8周時(shí)，取出進(jìn)行組織學(xué)

3、、組織化學(xué)檢測(cè)觀察軟骨細(xì)胞代謝活性變化；采用免疫熒光染色的方法檢測(cè)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)情況；組織切片F(xiàn)DA—EB雙熒光染色測(cè)定軟骨細(xì)胞存活率，以新鮮組作為對(duì)照組，對(duì)實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞存活率和代謝活性進(jìn)行比較研究。 結(jié)果： 1．關(guān)節(jié)軟骨PG的變化：關(guān)節(jié)軟骨保存2周，實(shí)驗(yàn)組PG即開(kāi)始減少（AOD值），與新鮮組比較，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組PG減少均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；組織培養(yǎng)組和慢速梯度降溫冷凍保存組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，二者與慢速連續(xù)降

4、溫冷凍保存組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。8周實(shí)驗(yàn)組PG與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），組織培養(yǎng)法對(duì)PG影響最小，慢速梯度降溫冷凍保存組其次，慢速連續(xù)降溫冷凍保存組PG影響最明顯。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)比較，保存處理對(duì)PG影響有時(shí)間依從性，2周與8周PG含量比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 2．關(guān)節(jié)軟骨膠原Ⅱ的變化：在2周時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，慢速連續(xù)降溫冷凍保存組

5、Collagen Ⅱ表達(dá)減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），組織培養(yǎng)組和慢速梯度降溫冷凍保存組減少無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；組織培養(yǎng)組和慢速梯度降溫冷凍保存組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，二者與慢速連續(xù)降溫冷凍保存組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。保存8周時(shí)，與新鮮組比較，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組CollagenⅡ表達(dá)均明顯減少，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；三個(gè)實(shí)驗(yàn)組間比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），組織培養(yǎng)組Collagen Ⅱ表達(dá)量最多，慢速梯

6、度降溫冷凍保存組其次，慢速連續(xù)降溫冷凍保存組表達(dá)最少。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)比較，保存處理對(duì)CollagenⅡ的影響有時(shí)間依從性，2周與8周CollagenⅡ含量比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 3．軟骨細(xì)胞存活率的變化：對(duì)照組細(xì)胞存活率96.22％±0.81％，在2周時(shí)間點(diǎn)，組織培養(yǎng)組細(xì)胞存活率85.13％±2.11％，慢速梯度降溫冷凍組細(xì)胞存活率72.49％±2.47％，慢速連續(xù)降溫冷凍組細(xì)胞存活率61.22％±3.32％，三

7、個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。8周時(shí)間點(diǎn)，組織培養(yǎng)組細(xì)胞存活率75.53％±2.64％，慢速梯度降溫冷凍保存組細(xì)胞存％率63.70％±4.11％，慢速連續(xù)降溫冷凍保存組細(xì)胞存活率42.10％±2.93％，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。保存處理對(duì)軟骨細(xì)胞存活率的影響具有動(dòng)態(tài)時(shí)間

8、依從性：三個(gè)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)比較，2周時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率和8周時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論： 1．在37℃條件下，組織培養(yǎng)法可以較長(zhǎng)期地在體外保存關(guān)節(jié)軟骨的活性，能夠顯著提高保存后軟骨細(xì)胞存活率和代謝能力。組織培養(yǎng)法是一種良好的軟骨組織保存方法，有望為臨床提供一種新的高生物活性移植材料。但是，移植效果有待進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的印證。 2．應(yīng)用玻璃化冷凍保護(hù)液預(yù)處理，慢速梯度降溫冷凍保存法，與傳統(tǒng)

9、冷凍方法比較，能夠明顯減輕關(guān)節(jié)軟骨組織凍傷，提高保存軟骨的活性，有一定的臨床使用價(jià)值。 3．三種保存方法對(duì)關(guān)節(jié)軟骨活性的影響均具有動(dòng)態(tài)的時(shí)間依從性。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，關(guān)節(jié)軟骨活性逐漸降低。 意義：關(guān)節(jié)軟骨缺損臨床上很常見(jiàn)，而且治療非常棘手，多種治療手段已運(yùn)用于關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)，但大多數(shù)療效不理想，修復(fù)組織也以纖維軟骨為多，缺乏正常透明軟骨的生物力學(xué)性能及耐用性，骨軟骨移植可以將完整的正常關(guān)節(jié)軟骨移植于關(guān)節(jié)缺損處，提供