不同保存方法對豬關節(jié)軟骨細胞存活率及代謝活性的影響.pdf

1、目的：通過組織培養(yǎng)法、慢速梯度降溫保存法和傳統(tǒng)慢速連續(xù)降溫保存法處理離體骨軟骨，以新鮮骨軟骨組作為對照，比較三種不同方法對關節(jié)軟骨組織形態(tài)、軟骨細胞存活率及代謝活性的不同影響。通過比較研究篩選出保存效果較好的方法，為臨床提供一種有活性的異體軟骨移植物。 方法：取3月齡同種系本地豬10只20膝關節(jié)。將供體豬處死后，無菌條件下在髕股關節(jié)及脛股關節(jié)切取正常骨軟骨，制成直徑約4.5mm、全長約5mm的圓柱形骨軟骨塊240枚。將骨軟骨塊隨

2、機分為4組，每組60枚。分別為對照組、組織培養(yǎng)組、慢速梯度降溫冷凍保存組、慢速連續(xù)降溫冷凍保存組。對照組不采取任何處理措施，半小時內直接取材檢測軟骨細胞存活率及代謝活性。慢速連續(xù)降溫冷凍保存組采取目前文獻報道的程序冷凍法處理保存；慢速梯度降溫冷凍保存組是把標本溫度降至－40℃以前分4個梯度降溫的保存方法；組織培養(yǎng)組將骨軟骨塊按體積比1：15放入配制的無菌RPMI1640培養(yǎng)液中37℃保存。各實驗組軟骨標本于保存2、8周時，取出進行組織學

3、、組織化學檢測觀察軟骨細胞代謝活性變化；采用免疫熒光染色的方法檢測軟骨Ⅱ型膠原表達情況；組織切片F(xiàn)DA—EB雙熒光染色測定軟骨細胞存活率，以新鮮組作為對照組，對實驗組軟骨細胞存活率和代謝活性進行比較研究。 結果： 1．關節(jié)軟骨PG的變化：關節(jié)軟骨保存2周，實驗組PG即開始減少（AOD值），與新鮮組比較，三個實驗組PG減少均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；組織培養(yǎng)組和慢速梯度降溫冷凍保存組間比較無統(tǒng)計學意義，二者與慢速連續(xù)降

4、溫冷凍保存組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。8周實驗組PG與對照組比較均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），實驗組間兩兩比較亦均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），組織培養(yǎng)法對PG影響最小，慢速梯度降溫冷凍保存組其次，慢速連續(xù)降溫冷凍保存組PG影響最明顯。兩個時間點實驗組內比較，保存處理對PG影響有時間依從性，2周與8周PG含量比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 2．關節(jié)軟骨膠原Ⅱ的變化：在2周時間點，與對照組比較，慢速連續(xù)降溫冷凍保存組

5、Collagen Ⅱ表達減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05），組織培養(yǎng)組和慢速梯度降溫冷凍保存組減少無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；組織培養(yǎng)組和慢速梯度降溫冷凍保存組間比較無統(tǒng)計學意義，二者與慢速連續(xù)降溫冷凍保存組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。保存8周時，與新鮮組比較，三個實驗組CollagenⅡ表達均明顯減少，均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；三個實驗組間比較亦有統(tǒng)計學意義（P<0.05），組織培養(yǎng)組Collagen Ⅱ表達量最多，慢速梯

6、度降溫冷凍保存組其次，慢速連續(xù)降溫冷凍保存組表達最少。兩個時間點實驗組內比較，保存處理對CollagenⅡ的影響有時間依從性，2周與8周CollagenⅡ含量比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 3．軟骨細胞存活率的變化：對照組細胞存活率96.22％±0.81％，在2周時間點，組織培養(yǎng)組細胞存活率85.13％±2.11％，慢速梯度降溫冷凍組細胞存活率72.49％±2.47％，慢速連續(xù)降溫冷凍組細胞存活率61.22％±3.32％，三

7、個實驗組與對照組比較均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），實驗組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。8周時間點，組織培養(yǎng)組細胞存活率75.53％±2.64％，慢速梯度降溫冷凍保存組細胞存％率63.70％±4.11％，慢速連續(xù)降溫冷凍保存組細胞存活率42.10％±2.93％，三個實驗組與對照組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05），三個實驗組之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。保存處理對軟骨細胞存活率的影響具有動態(tài)時間

8、依從性：三個實驗組內比較，2周時間點細胞存活率和8周時間點細胞存活率差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論： 1．在37℃條件下，組織培養(yǎng)法可以較長期地在體外保存關節(jié)軟骨的活性，能夠顯著提高保存后軟骨細胞存活率和代謝能力。組織培養(yǎng)法是一種良好的軟骨組織保存方法，有望為臨床提供一種新的高生物活性移植材料。但是，移植效果有待進一步體內實驗的印證。 2．應用玻璃化冷凍保護液預處理，慢速梯度降溫冷凍保存法，與傳統(tǒng)

9、冷凍方法比較，能夠明顯減輕關節(jié)軟骨組織凍傷，提高保存軟骨的活性，有一定的臨床使用價值。 3．三種保存方法對關節(jié)軟骨活性的影響均具有動態(tài)的時間依從性。隨著保存時間的延長，關節(jié)軟骨活性逐漸降低。 意義：關節(jié)軟骨缺損臨床上很常見，而且治療非常棘手，多種治療手段已運用于關節(jié)軟骨損傷的修復，但大多數(shù)療效不理想，修復組織也以纖維軟骨為多，缺乏正常透明軟骨的生物力學性能及耐用性，骨軟骨移植可以將完整的正常關節(jié)軟骨移植于關節(jié)缺損處，提供