ICa,L與IKr之間的相互作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景和目的：
　　心臟的最基本的電活動是動作電位（AP），而動作電位是由多種離子流共同參與構(gòu)成。它包括除極過程與復(fù)極過程，其中復(fù)極過程較復(fù)雜對動作電位時程(APD)影響大。近年許多研究證明了心臟離子流存在相互作用，心臟中的L型鈣通道(ICa,L，L-type calcium channel)是一種電壓依賴性通道，其電流參與動作電位2相（平臺期）的形成?？焖偌せ钛舆t整流鉀通道（IKr，rapidly activated delaye

2、d rectifierpotassium channel）也是心臟的一種電壓依賴性通道，其電流主要參與動作電位3相（快速復(fù)極末期）。本實驗通過研究乳鼠心室肌細(xì)胞的ICa,L與IKr的電流特性以及ICa,L與IKr中的主要亞基Cav1.2與HERG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞）的Cav1.2、HERG通道電流，來了解是否兩電流之間存在相互作用，并明確其相互作用的機(jī)制。
　　第一部分 wistar乳鼠心室肌細(xì)胞ICa,L與IK

3、r電流研究
　　方法：
　　分離和培養(yǎng)Wistar乳鼠心室肌細(xì)胞，運用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測定心室肌原始ICa,L以及IKr。加入Dofetilide多非利特（鉀通道阻滯劑）記錄 ICa,L的變化；分別加入 Bay K8644（鈣通道激動劑）、CdCl2（鈣通道阻滯劑）、W7（鈣調(diào)蛋白抑制劑）、KN93（鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ抑制劑）記錄IKr的變化。
　　結(jié)果：
　　1、加入Dofetilide阻滯IKr后，ICa，L電流

4、的峰值電流密度（電壓鉗制在0mV時）從（-9.76±0.37）pA/pF，升至（-11.62±0.41）pA/pF，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而加藥后ICa,L穩(wěn)態(tài)失活曲線V1/2為-21.21±0.97 mV，k=9.85±0.90mV，與加藥前V1/2-25.85±0.91mV，k6.50±0.84相比V1/2明顯右移了4.6mV，k增大了3.35mV，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、加入Bay K864

5、4激活I(lǐng)Ca,L后，使IKr的電流幅值明顯下降，其峰值電流（電壓鉗制在50mV時）密度從（18.79±0.32）pA/pF，降至（14.09±0.52）pA/pF，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.加入CdCl2、W7、Kn93后，分別阻滯了ICa,L、鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ，其峰值電流密度分別為（電壓鉗制在50mV時），（26.13±2.35）pA/pF、（26.43±1.72）pA/pF、（25.93±1.88）

6、pA/pF，與加藥前峰值電流密度（18.79±1.32）pA/pF相比，都有明顯上升，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但電流曲線形狀都不改變。并且加藥后3種IKr電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線與加藥前相比都無明顯差異性。
　　結(jié)論：
　　1.IKr的電流變化，不會改變ICa,L電流的形態(tài)以及激活過程，但可影響ICa,L的電流幅值和失活過程。
　　2.ICa,L的電流變化，也可影響IKr的電流幅值，但不改變其電流形態(tài)，也不改變電

7、流激活過程。
　　3.C a2+、鈣調(diào)蛋白（CaM）以及鈣調(diào)蛋白激酶2型（CaMKII）的變化，都可改變IKr電流幅值，且三者變化幅度相當(dāng)。提示ICa,L對IKr電流的作用是通過Ca2+/CaM/CaMKII途徑發(fā)生。
　　第二部分轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞的Cav1.2與HERG通道電流的研究
　　方法：
　　利用免疫磁珠（CD8+）陽性標(biāo)記法制作Cav1.2通道與 HERG通道表達(dá)系統(tǒng)。測定通道電流的I-V曲線、

8、穩(wěn)態(tài)激活曲線、穩(wěn)態(tài)失活曲線，比較單轉(zhuǎn)與共轉(zhuǎn)通道電流的區(qū)別。
　　結(jié)果：
　　1.Cav1.2對HERG電流密度的影響：與Cav1.2共同轉(zhuǎn)染后，HERG通道峰電流以及尾電流的峰值電流密度均減小，其峰電流以及尾電流的峰值電流密度分別從27.79±1.87pA/pF、42.6±1.52pA/pF，下降至20.48±1.57pA/pF、34.72±1.62 pA/pF，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.Cav1.2

9、對HERG電流穩(wěn)態(tài)激活曲線的作用：單獨轉(zhuǎn)染的HERG通道電流穩(wěn)態(tài)激活曲線V1/2為4.79±2.24mV，k為9.68±2.11 mV，與Cav1.2共同轉(zhuǎn)染后的HERG通道穩(wěn)態(tài)激活曲線V1/2為4.54±1.27 mV，k為9.91±1.22 mV，兩者無明顯差異。
　　3.HERG對Cav1.2電流密度的影響：與HERG共同轉(zhuǎn)染后，Cav1.2通道峰值電流密度減小，在10mv下的峰值電流密度從-11.31±0.51pA/pF，

10、下降至-8.31±0.52pA/pF，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　4.HERG對Cav1.2電流穩(wěn)態(tài)激活和穩(wěn)態(tài)失活曲線的作用：單獨轉(zhuǎn)染的Cav1.2通道和與HERG共同轉(zhuǎn)染后的Cav1.2通道相比，兩者穩(wěn)態(tài)激活曲線無明顯差異性。而共轉(zhuǎn)之后通道的穩(wěn)態(tài)失活曲線與單獨的Cav1.2通道相比V1/2明顯左移了4.8mV，斜率K下降了3.1mV，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.Cav1.2通道