不同濃度雌二醇及PGE2對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖及PCNA表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：
　　子宮內(nèi)膜在人體內(nèi)作為一個(gè)高度再生的組織，在雌孕激素的作用下發(fā)生周期性的變化。雌激素可促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)，其在體內(nèi)的變化受下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)節(jié)。當(dāng)一些原因?qū)е伦訉m內(nèi)膜損傷，使子宮前后壁粘連、官腔閉鎖，就可形成宮腔粘連(Intrauterine adhesions，IUA)。近年來隨著人流、藥流手術(shù)及宮腔操作的增多，IUA已成為婦科常見病之一，并且成為不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)的一項(xiàng)重要原因。IUA治愈率低下，手術(shù)分離后粘連

2、易發(fā)，嚴(yán)重影響著廣大女性的身體及心理健康。因此粘連分離術(shù)后如何防止粘連復(fù)發(fā)、促進(jìn)內(nèi)膜生長(zhǎng)的治療是臨床工作的一大難題。目前IUA分離術(shù)后多采用人工周期治療2～3個(gè)月促進(jìn)子宮內(nèi)膜的再生，防止粘連復(fù)發(fā)。但雌激素劑量及療程目前尚無明確規(guī)定，主要是根據(jù)患者的粘連程度、類型以及術(shù)者的經(jīng)驗(yàn)，且治療效果并不太滿意，子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)并不能得到很好的改善。有些學(xué)者認(rèn)為對(duì)雌激素生理劑量無效的子宮內(nèi)膜，可加大雌激素劑量促進(jìn)子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)。但也有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜基

3、底層嚴(yán)重受損后，內(nèi)膜再生能力下降，高雌激素水平可能導(dǎo)致某些纖維化細(xì)胞因子水平的上升，反而促進(jìn)IUA的形成。目前，雌激素的不同用量以及應(yīng)用時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)作用的影響尚不明確。
　　感染對(duì)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)的影響目前尚無明確定論，一些學(xué)者認(rèn)為宮腔操作后沒有必要使用抗生素預(yù)防感染。但是一旦出現(xiàn)感染，炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜損傷加劇，并引起子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙，加速IUA的再形成。在所有的致炎因子中，前列腺素E2(Prostaglandin

4、 E2，PGE2)是一種重要的細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)因子，對(duì)多種細(xì)胞的增殖及生物學(xué)功能有調(diào)節(jié)作用，并與子宮內(nèi)膜生理及病理密切相關(guān)。它能誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞中膠原生物的合成，促進(jìn)炎性區(qū)域發(fā)生纖維化改變。但前列腺素E2對(duì)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)的影響以及對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞有何種調(diào)節(jié)作用尚不明確。
　　目的：
　　本課題通過子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代系統(tǒng)，應(yīng)用不同濃度、不同時(shí)間雌二醇及炎癥因子前列腺素E2作用于細(xì)胞，采用MTT法及Real-tim

5、ePCR法觀察雌二醇及炎癥因子PGE2對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖情況的影響，為進(jìn)一步探索宮腔粘連分離術(shù)后輔助雌激素治療以及炎癥對(duì)內(nèi)膜增長(zhǎng)有無影響提供一個(gè)前期的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1.采用膠原酶消化法及篩網(wǎng)法分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，MTT法繪制細(xì)胞正常生長(zhǎng)曲線，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)周期。通過形態(tài)學(xué)及免疫組化法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　2.將人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分為對(duì)照組:加入正常培養(yǎng)液。雌二醇組:分別加入濃度為1(

6、×)10-9、10-8、10-7、10-6mol/L雌二醇。雌二醇+PGE2組:同時(shí)分別加入不同濃度的雌二醇(10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)和PGE2(濃度為50ng/L)。PGE2組:單獨(dú)加入PGE2(濃度為50ng/L)。MTT法間接測(cè)定各組別子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)PCNAmRNA表達(dá)的變化。
　　3.將所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，兩個(gè)獨(dú)立樣本間的比較

7、采用t檢驗(yàn)方法分析數(shù)據(jù)之間的差異，各組間資料的分析采用單因素方差分析法，采用LSD-t法進(jìn)行組間兩兩比較。各組不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測(cè)量資料設(shè)計(jì)法分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn):培養(yǎng)出的基質(zhì)細(xì)胞多為多角形，細(xì)胞兩端有多個(gè)短小突起，細(xì)胞排列無極性，貼壁生長(zhǎng)。隨著細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，細(xì)胞逐漸拉長(zhǎng)成梭形，具有成纖維細(xì)胞形態(tài)。
　　2.細(xì)胞生長(zhǎng)周期及免疫組化結(jié)果:細(xì)胞生長(zhǎng)周期一般為7-10天，第

8、1天為潛伏生長(zhǎng)期，第2-4天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5-6天后達(dá)平臺(tái)期，7天后逐漸萎縮消退。基質(zhì)細(xì)胞特異的波形蛋白抗體(Vimentin)染色陽性，陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，角蛋白抗體染色陰性。
　　3.隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，雌二醇組基質(zhì)細(xì)胞增殖率明顯升高，細(xì)胞增殖呈時(shí)間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），而各組濃度之間并無明顯差異(P＞0.05）。24h雌二醇+PGE2組與雌二醇組比較，細(xì)胞平均增殖率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

9、）。72h雌二醇+PGE2組細(xì)胞隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)雖有增長(zhǎng)趨勢(shì)，但與雌二醇組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯下降（P＜0.05）。PGE2組細(xì)胞增殖率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)明顯下降（P＜0.05）。
　　4.隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，72h雌二醇組細(xì)胞PCNAmRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，與48h、24h相比，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），而各組濃度之間無明顯差異(P＞0.05）。24h雌二醇+PGE2組與雌二醇組比較，PCNAmRNA的相對(duì)表

10、達(dá)量升高(P＜0.05)。72h雌二醇+PGE2組細(xì)胞PCNAmRNA的相對(duì)表達(dá)量隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，但與雌二醇組相比，明顯下降(P＜0.05）。PGE2組細(xì)胞PCNAmRNA的相對(duì)表達(dá)量隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)明顯下降(P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.體外成功分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)學(xué)及波形蛋白染色陽性均符合子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞特征。
　　2.雌二醇可促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖，但增殖作用非濃度依賴性而