神經(jīng)生長因子啟動哮喘腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞冗余性致腎上腺素釋放障礙及蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究.pdf

1、支氣管哮喘是一種氣道炎癥性疾病，其炎癥發(fā)生與調(diào)控氣道的神經(jīng)系統(tǒng)之間存在復(fù)雜的相互作用。近年來，眾多的實(shí)驗(yàn)證明哮喘狀態(tài)下神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)明顯增高，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘大鼠神經(jīng)生長因子及其受體表達(dá)升高，因此，學(xué)術(shù)界越來越關(guān)注氣道神經(jīng)源性炎癥在哮喘發(fā)病中的作用。有研究提示哮喘狀態(tài)下腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞可能存在腎上腺素的合成和(或)釋放障礙，同時(shí)外源性NGF可以使腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞向神經(jīng)元方

2、向轉(zhuǎn)化，那么哮喘狀態(tài)下血清中增高的NGF是否對腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞產(chǎn)生形態(tài)上的影響并進(jìn)而導(dǎo)致其內(nèi)分泌功能的下降?以及具體的機(jī)制如何?近來細(xì)胞冗余性概念的提出為腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞分化障礙提供了可能的理論支撐點(diǎn)。冗余性是指細(xì)胞除了必備的功能外還具有“多于必須"的功能，所謂的細(xì)胞可塑性也就是指冗余性在細(xì)胞表型上的轉(zhuǎn)分化表現(xiàn)。在非生理情況下，細(xì)胞的冗余性功能可能啟動，導(dǎo)致其專職功能下降或消失，而其兼職功能加強(qiáng)。本研究分別通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討哮喘

3、狀態(tài)下腎上腺素釋放障礙的可能原因，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法分離和鑒定其中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。 第一章支氣管哮喘大鼠腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞表型改變與NGF表達(dá)水平初探 目的:觀察支氣管哮喘狀態(tài)下大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞(AMCC)形態(tài)學(xué)的改變以及NGF在腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞中的表達(dá)。 方法:利用光鏡觀察哮喘大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)結(jié)合顯微圖象分析觀察哮喘大鼠髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞中NGF的表達(dá)變化。 結(jié)果:H

4、E染色光鏡下觀察都可以見到腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞不同程度的空泡變性樣改變，脂質(zhì)增多，少數(shù)可見纖維樣物質(zhì)伸向皮質(zhì)。與正常對照組(112.23±2.51)相比，哮喘組(121.79±3.24)大鼠NGF免疫陽性反應(yīng)在腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞明顯上調(diào)(P<0.05)。 結(jié)論:支氣管哮喘時(shí)腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞NGF的表達(dá)增高并出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變，可能導(dǎo)致腎上腺素合成與釋放不足而參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展。 第二章神經(jīng)生長因子啟動哮喘大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜

5、鉻細(xì)胞冗余性致腎上腺素釋放障礙 目的:探討支氣管哮喘(簡稱哮喘)狀態(tài)下腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞釋放腎上腺素不足的可能原因，明確神經(jīng)生長因子(NGF)在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法:雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為對照組、哮喘組、NGF干預(yù)組、抗NGF抗體干預(yù)組、SP組，每組8只，分別干預(yù)各組大鼠。電鏡觀察腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，免疫組織化學(xué)結(jié)合顯微圖像分析各組大鼠髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞中苯乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PNMT)的表達(dá)變化

6、，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測各組大鼠血清中腎上腺素和去甲腎上腺素的變化。 結(jié)果:電鏡觀察可見：(1)哮喘組、NGF組和抗NGF抗體干預(yù)組大鼠腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞線粒體增多，并且嗜鉻顆粒減少；(2)NGF組腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞膜可見杵狀和絨毛狀突起。圖像分析結(jié)果顯示NGF組PNMT 平均灰度值(A)為218±38，與對照組(182±25)、哮喘組(198±33)、抗NGF組(195±41)和SP組(195.46±39.82)比

7、較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為23.42、19.76、17.93、18.21，P均<0.05)；ELISA結(jié)果顯示NGF組血清腎上腺素濃度為(2.9±0.5)ng/ml、與對照組[(7.1±0.4)ng/ml]、哮喘組[(5.9±1.7)ng/ml]、抗NGF組[(5.7±0.6)ng/ml]和SP組[(5.91±1.58)ng/ml]比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為7.64、5.41、4.96、5.12 P均<0.01)，哮喘組與對

8、照組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.64，P<0.01)，哮喘組和抗NGF組腎上腺素水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.87，P>0.05)。 結(jié)論:NGF通過啟動腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞的功能冗余性使其表型和功能發(fā)生轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腎上腺素水平下降而參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展。 第三章神經(jīng)生長因子啟動原代培養(yǎng)的腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞功能冗余性致腎上腺素釋放障礙 目的:觀察NGF等對原代培養(yǎng)的腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞生物行為學(xué)的影響，探討可能的機(jī)

9、制。 方法:采用單細(xì)胞消化法原代培養(yǎng)腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞，密度梯度離心和差速貼壁法分離和純化腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞。相差顯微鏡、電鏡觀察外源性NGF、SP作用下腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變，ELISA法檢測培養(yǎng)上清夜中腎上腺素和去甲腎上腺素濃度的變化。 結(jié)果：NGF干預(yù)后2天相差顯微鏡下可見腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞膜表面漸漸長出長絲狀突起。電鏡下NGF干預(yù)后可見腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞表面豐富的杵狀和絨毛狀突起，近細(xì)胞膜處可見小囊泡形成，細(xì)

10、胞漿內(nèi)線粒體豐富，結(jié)構(gòu)較模糊，部分嵴丟失。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)NGF干預(yù)后培養(yǎng)上清液中腎上腺素濃度較正常組明顯降低(P<0.05)，去甲腎上腺素濃度沒有明顯改變。SP干預(yù)后腎上腺素和去甲腎上腺素濃度沒有明顯改變。 結(jié)論:NGF通過啟動腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞功能冗余性使其表型和功能發(fā)生改變致腎上腺素合成和釋放障礙。 第四章 NGF啟動腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞冗余性的蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究 目的:初步明確NGF啟動腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞冗

11、余性過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，為支氣管哮喘的進(jìn)一步的治療提供新的思路和可能的治療靶點(diǎn)。 方法:運(yùn)用二維凝膠電泳、質(zhì)譜分析法并結(jié)合生物信息學(xué)方法分離和鑒定NGF干預(yù)后的差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果:二維凝膠電泳獲取腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞正常組和NGF干預(yù)組的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為752±34和693±46，NGF干預(yù)組出現(xiàn)有意義的表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)為48個(gè)，下調(diào)點(diǎn)為37個(gè)，隨機(jī)選取14個(gè)表達(dá)上調(diào)，6個(gè)表達(dá)下調(diào)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MOLDI-TOF質(zhì)譜鑒

12、定。質(zhì)譜鑒定獲得了17張較好的肽質(zhì)量指紋圖譜。本實(shí)驗(yàn)通過Mascot軟件檢索MSDB數(shù)據(jù)庫和Profound軟件檢索MSDB數(shù)據(jù)庫初步鑒定17個(gè)可能與NGF啟動腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞冗余性致腎上腺素釋放障礙過程中相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Rho GDP dissociation inhibitor(GDI)alpha、分子伴侶蛋白HSP27、外周蛋白中間絲蛋白(Peripherin intermediatefilament prot

13、ein)可能在此過程發(fā)揮重要作用。 結(jié)論:RhoGDI α蛋白、分子伴侶蛋白HSP27、外周蛋白中間絲蛋白可能在NGF啟動腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞冗余性過程中發(fā)揮重要作用。 結(jié)論 1.支氣管哮喘狀態(tài)下，腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞NGF表達(dá)增高，提示腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞可能也是NGF的來源之一。 2.支氣管哮喘大鼠存在腎上腺素合成和釋放障礙。 3.神經(jīng)生長因子可能通過啟動哮喘大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞冗余性致腎上腺素釋