腦新型分子標(biāo)志vsnl1基因的克隆、原核表達(dá)及在缺血性腦卒中大鼠模型的轉(zhuǎn)錄研究.pdf

1、腦缺血性卒中(ischemic stroke,IS)在世界范圍內(nèi)均有很高的發(fā)病率、死亡率及神經(jīng)致殘率。隨著老齡化社會(huì)的到來,IS發(fā)病率正逐步增加,對人類健康的危害還在進(jìn)一步加大。盡管借助現(xiàn)有的CT、MRI等影像學(xué)技術(shù),可以檢查出多數(shù)IS,但在疾病早期甚至有些情況下,能夠及時(shí)做出診斷仍有困難。而發(fā)現(xiàn)與腦缺血性損傷相關(guān)的特異性和敏感性分子標(biāo)志,有助于建立新的早期分子診斷方法。2006年6月,華盛頓大學(xué)Ladenson研究小組報(bào)道,采用基因陣

2、列技術(shù)、生物信息學(xué)分析初篩結(jié)合Western blot進(jìn)一步印證的策略,篩選出腦高豐度、高特異表達(dá)的蛋白：視錐蛋白樣蛋白-1(visinin-like protein 1,VILIP-1);并且在IS患者和動(dòng)物模型體內(nèi),他們亦檢測到VILIP-1表達(dá)上調(diào)。因此,VILIP-1有望成為缺血性腦損傷重要的分子標(biāo)志。 Vsnl1是VILIP-1蛋白的編碼基因,其cDNA全長576 bp。GenBank數(shù)據(jù)庫資料顯示,在人類、小鼠和大鼠

3、,vsnl1序列基本相同,并且在基底節(jié)、前腦、小腦和大腦等腦組織和絕大多數(shù)的腦神經(jīng)細(xì)胞均有高豐度表達(dá)。VILIP-1隸屬神經(jīng)鈣傳感蛋白(NCS)家族中VILIP亞家族成員,其在健康腦組織的組成性表達(dá)特征已獲初步闡明,但作為一個(gè)與IS密切相關(guān)的重要分子,在相關(guān)動(dòng)物模型乃至IS患者的表達(dá)特性仍不清楚。本研究對vsnl1進(jìn)行了克隆和原核表達(dá),并建立了線栓法IS大鼠模型,進(jìn)一步對vsnl1基因的轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行了研究。 一、Vsnl1基

4、因的克隆與原核表達(dá) 首先,通過PrimerSelect軟件優(yōu)化設(shè)計(jì)引物序列。然后,取健康BALB/c小鼠全腦,用BIOZOL試劑進(jìn)行總RNA提取和純化。以RNase-free DNase I消化去除殘存DNA后,行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA,并以后者為模板行PCR反應(yīng)擴(kuò)增vsnl1。將PCR目的片段連接至pMD18-T,經(jīng)酶切和測序鑒定后,將序列提交GenBank,并行BLAST比對、分析。經(jīng)亞克隆技術(shù),構(gòu)建含6×His標(biāo)簽的原核表

5、達(dá)質(zhì)粒pROEX-v,轉(zhuǎn)化宿主菌DH5a,行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及Ni-NTA柱純化。結(jié)果表明：(1)通過兩步法RT-PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物為576 bp,和vsnl1基因預(yù)期大小一致；(2)經(jīng)序列測定及BLAST比對分析,提示存在nt205(T-C)和nt314(T-A)兩個(gè)突變位點(diǎn),與已公布的vsnl1同源性為99％,基因序列已提交GenBank,獲登錄號(hào)為EU373446：(3)成功構(gòu)建pROEX-v,誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE證實(shí),在

6、約22 kDa處有目的蛋白條帶,與預(yù)期分子量大小一致；(4)對Ni-NTA柱純化樣品行SDS-PAGE分析,結(jié)果同樣顯示,在約22 kDa處出現(xiàn)純化的目的蛋白條帶,但得率略低。 二、缺血性腦卒中大鼠模型的制備及vsnl1的轉(zhuǎn)錄研究 首先,參考文獻(xiàn)報(bào)道的線栓法制模方法,建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral arterial occlusion,MCAO)模型,永久性(pMCAO)和短暫性(tMCAO)

7、阻塞模型動(dòng)物各11只,10只未行MCA阻塞的大鼠為對照。對動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評分,并對腦切片進(jìn)行組織病理學(xué)鑒定。其次,心臟灌注后取腦,提取各組腦標(biāo)本的梗塞(右)側(cè)和未梗塞(左)側(cè)總RNA,徹底消化去除殘留DNA后逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。 再次,行半定量PCR,并用Quantity One軟件行灰度掃描,將vsnl1對于β-actin的光密度積分比值作為半定量指標(biāo),進(jìn)行比較分析。最后,通過DNAMAN、PrimerSelect軟件優(yōu)化設(shè)

8、計(jì)熒光定量PCR引物,采用熒光定量PCR方法,以各組腦標(biāo)本的梗塞側(cè)和未梗塞側(cè)cDNA為模板,進(jìn)一步對vsnl1轉(zhuǎn)錄水平行定量檢測分析。 結(jié)果表明：(1)神經(jīng)病學(xué)評分顯示,梗塞術(shù)后24h,MCAO大鼠均表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)功能缺損癥狀(pMCAO,2.64±1.03:tMCAO,2.27±0.90：對照,0),pMCAO和tMCAO組與對照組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),而pMCAO和tMCAO組間無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)

9、果還提示,tMCAO組大鼠較pMCAO組似乎有更長的生存時(shí)間,提示早期再灌注有益于延長IS模型生存時(shí)間。(2)TTC染色顯示,在pMCAO和tMCAO大鼠模型腦組織的右側(cè)MCA供血區(qū),包括大腦皮層、紋狀體和海馬等部位,均可見明顯的梗塞灶；而正常大鼠及MCAO大鼠的左側(cè)大腦為均勻紅染區(qū)域、無梗塞灶。HE染色鏡下結(jié)果顯示,MCAO大鼠的梗塞側(cè)腦組織有較多的梗塞灶和微梗塞灶,同時(shí),還可見細(xì)胞水腫、變性、壞死等病理學(xué)變化,而對照正常。尚發(fā)現(xiàn),p

10、MCAO鼠較tMCAO梗塞病灶更為嚴(yán)重,表現(xiàn)為梗塞面積大和病灶數(shù)量多。(3)半定量PCR結(jié)果顯示,在對照組,左右兩側(cè)腦組織vsnl1轉(zhuǎn)錄水平相似。而在pMCAO和tMCAO組,缺血側(cè)腦組織vsnl1轉(zhuǎn)錄水平低于非缺血側(cè)。(4)熒光定量PCR顯示,vsnl1的相對轉(zhuǎn)錄水平(vsnl1 mRNA/β-actin mRNA),在pMCAO非缺血側(cè)為0.040±0.007,缺血側(cè)為0.023±0.002：在tMCAO非缺血側(cè)為0.049±0.0