大腸癌患者糞便與癌組織APC基因突變檢測(cè)的一致性研究.pdf

1、背景：大腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)生命健康。由于大腸癌起病隱匿，早期多無(wú)明顯癥狀，一旦出現(xiàn)癥狀，大多已是中晚期。大腸癌患者的生存率直接與診斷時(shí)的疾病的進(jìn)展程度有關(guān)。當(dāng)大腸癌患者癌灶局限于腸壁時(shí)（A期或B期），五年生存率>75％，當(dāng)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，患者的五年生存率則降至30%-60%。因此，對(duì)大腸癌早期有效的篩查診斷，能夠大大的提高患者的生存率，降低病死率。目前最常用的篩查方法是糞便潛血實(shí)驗(yàn)，但其特異性低、且易受到食

2、物的影響。研究認(rèn)為，大腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)受多基因、多階段、多步驟調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，此過(guò)程常與細(xì)胞增殖、凋亡失控有關(guān)，涉及癌基因激活、抑癌基因失活、錯(cuò)配修復(fù)基因以及一些修飾基因的改變。某種基因的改變只是在大腸癌發(fā)生的某一階段以高頻率出現(xiàn)，從而導(dǎo)致大腸癌的發(fā)生。其中涉及與大腸癌有關(guān)的有APC、MMR、DCC、P53抑癌基因和K-ras、C-myc原癌基因的突變。APC基因是家族性腺瘤樣息肉病(familial adenomatous pol

3、yposis，F(xiàn)AP)的易感基因，是大腸腫瘤發(fā)生的早期分子事件，但穩(wěn)定于腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程。近年研究表明，APC基因在85%的結(jié)腸癌中缺失或失活，并且該基因的缺失與結(jié)腸癌的遺傳易感性密切相關(guān)。已有研究表明，糞便與組織中APC基因聯(lián)合檢測(cè)對(duì)大腸癌高危人群的篩查診斷具有較高的特異性，并且減少行內(nèi)窺鏡檢查的痛苦。本課題運(yùn)用蛋白截短檢測(cè)技術(shù)（PTT），檢測(cè)散發(fā)性大腸癌患者的癌組織及糞便脫落細(xì)胞APC基因的突變，探索糞便基因檢測(cè)代替組織基因檢測(cè)

4、的可行性。
　　目的：利用蛋白截短檢測(cè)技術(shù)（PTT）聯(lián)合檢測(cè)散發(fā)性大腸癌患者糞便及癌組織中APC基因的突變，探討其在大腸癌篩查中的作用及建立無(wú)創(chuàng)性篩查大腸癌方法的可行性，從而探索大腸癌早期診斷既經(jīng)濟(jì)有效又快捷的篩查方法。
　　方法：（1）收集寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2011年10月-2012年10月期間，50例行腸鏡活檢診斷為大腸癌的患者，并經(jīng)手術(shù)切除病理學(xué)明確診斷為散發(fā)性大腸癌患者的糞便3-5g（術(shù)前收集），少量癌組織（大于1

5、g）；30例經(jīng)胃腸鏡及其他影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)、物理學(xué)檢查確診為正常人群的糞便3-5g，少量腸粘膜組織（大于1 g）。以上標(biāo)本均在-80℃保存，共計(jì)80例，擴(kuò)增目的DNA。（2）運(yùn)用蛋白截短檢測(cè)技術(shù)（PTT），對(duì)50例散發(fā)性大腸癌患者的癌組織和糞便脫落細(xì)胞及30例正常人群的腸粘膜組織和糞便脫落細(xì)胞中APC基因第15外顯子進(jìn)行截短型突變檢測(cè)，并兩兩進(jìn)行對(duì)比，比較正常人群與大腸癌患者糞便及癌組織APC基因突變的情況。（3）對(duì)檢測(cè)出有突變基因的糞便及

6、組織進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討散發(fā)性大腸癌患者的糞便與癌組織中APC基因第15外顯子突變的陽(yáng)性率有無(wú)差異。
　　結(jié)果：（1）用組織提取的DNA為模板，擴(kuò)增目的基因成功率100%（50/50），用糞便提取的DNA為模板，擴(kuò)增目的基因成功率86%（43/50）。（2）應(yīng)用熒光標(biāo)記的數(shù)字化PTT技術(shù)對(duì)50例大腸癌組織標(biāo)本的APC基因第15外顯子進(jìn)行截短型突變檢測(cè)，共檢出17例截短型突變（其中引物15A檢出4例突變，引物15B檢出7例突變，引物

7、15C檢出2例突變，引物15 D檢出4例突變）,突變率為34%；對(duì)50例糞便標(biāo)本的APC基因第15外顯子進(jìn)行截短型突變檢測(cè)，共檢出14例截短型突變（其中引物15A檢出2例突變，引物15B檢出6例突變，引物15C檢出2例突變，引物15D檢出4例），突變率為32.6%。其中有13例癌組織及對(duì)應(yīng)的糞便均陽(yáng)性。（3）30例正常人群的大腸粘膜組織及糞便脫落細(xì)胞中APC基因第15外顯子進(jìn)行截短型突變檢測(cè)均未檢測(cè)出有突變。（4）散發(fā)性大腸癌患者癌組織

8、與糞便脫落細(xì)胞APC基因第15外顯子截短型突變率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2檢驗(yàn)P>0.05）。Kappa值為0.749，大腸癌患者的癌組織中APC基因及糞便脫落細(xì)胞APC基因檢測(cè)的一致性較好。
　　結(jié)論：（1）糞便中檢測(cè)APC基因突變?cè)诖竽c癌的早期篩查中具有可行性。（2）大腸癌患者的癌組織檢測(cè)APC基因與糞便脫落細(xì)胞檢測(cè) APC基因的一致性較好，為糞便替代癌組織進(jìn)行APC基因檢測(cè)提供了可行性的依據(jù)。（3）蛋白截短檢測(cè)技術(shù)（PTT）