食管鱗癌免疫組化標(biāo)志物TP-Alpha,Collagen Alpha-1(VI)Chain和S100A9的鑒定.pdf

1、研究背景與目的：
　　 食管癌是世界上常見的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的最新資料顯示，2008年度全世界67億人口新發(fā)食管癌48.2萬例，發(fā)病率為7.0/10萬，居全部惡性腫瘤第9位；死亡40.7萬例，死亡率5.8/10萬，居第8位。其發(fā)病率具有明顯的地域差異，其中，東亞、東非和南非是高發(fā)地區(qū)，西非、中非及中美洲是低發(fā)區(qū)，兩者相差16倍。發(fā)病率的男女性別比為3～4倍。中國大陸13.4億人口中食管癌新發(fā)25.9萬例，發(fā)病率為

2、16.7/10萬，居全國各類惡性腫瘤第5位；死亡21.1萬例，死亡率為13.4/10萬，居第4位。食管癌的病理類型表現(xiàn)為中、上三分之一的鱗狀上皮細胞癌和下三分之一與胃食管交界處的腺癌。從中亞的伊朗北部到東亞的華中華南，是被稱為“食管癌帶”的食管癌高發(fā)區(qū)，90％以上是鱗狀上皮細胞癌。
　　 近幾十年來，盡管在食管癌的診斷與治療方面新技術(shù)、新手段層出不窮，但食管癌的預(yù)后并未明顯改善。究其原因在于半數(shù)以上的患者在首次就診時已屬于中晚期

3、，而這些患者即使行以手術(shù)為主的綜合治療，仍有40％～50％患者死于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。食管早期癌治療后5年生存率高達90％～100％，而進展期癌5年生存率低至10％左右，這與現(xiàn)有治療方法對早期患者治療的有效性有關(guān)，因此，提高食管癌患者生存率關(guān)鍵在于早期診斷。
　　 作為食管鱗狀上皮細胞癌早期診斷的一項技術(shù)，食管拉網(wǎng)細胞學(xué)檢查已經(jīng)應(yīng)用于臨床，尤其是在食管癌高發(fā)區(qū)，針對大批無癥狀人群的篩查具有重要意義，但其靈敏度比較低(14％～36％)，目

4、前已被內(nèi)鏡下診斷加病理活檢取代。理想的診斷診斷方法應(yīng)該具備靈敏度高、特異性強、微創(chuàng)和簡便易行，不需要專家的特別解釋。內(nèi)鏡活檢監(jiān)測具有侵襲性且價格昂貴，操作難度大，費時費力，不能滿足上述要求。目前多重活檢、福爾馬林固定后行免疫組化檢查，可以滿足上述需要。免疫組化可以對分子生物學(xué)標(biāo)志物進行定性、定位及定量分析，是在組織水平上常用的診斷方法。目前用來預(yù)測可以發(fā)展為食管鱗狀上皮細胞癌的分子生物學(xué)標(biāo)志物主要有MCM-2、cyclin-A等，但其診

5、斷的準(zhǔn)確性較低，因此，鑒定食管鱗狀上皮細胞癌早期診斷新的分子生物學(xué)標(biāo)志物是臨床亟待解決的問題。
　　 現(xiàn)在，高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以描繪出疾病與對照之間全蛋白組水平上蛋白質(zhì)的變化譜圖，可以把組織、血清等多種樣本作為研究對象。差異蛋白質(zhì)組學(xué)通過對差異蛋白質(zhì)的篩查特別適用于對疾病機制的研究，提供差異蛋白質(zhì)的信息，進而鑒定出對疾病診斷、分子治療及預(yù)后判斷有關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)志物。同位素試劑的差異標(biāo)簽標(biāo)記技術(shù)，比如同位素相對絕對定量試劑盒

6、(iTRAQ)結(jié)合多維液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜在疾病標(biāo)志物的篩查及鑒定中意義日漸突出。我們采用這一方法曾對結(jié)直腸癌差異蛋白進行研究，鑒定到一組有重要意義的結(jié)直腸癌標(biāo)志物。本研究采用了iTRAQ試劑盒結(jié)合多維液相色譜分離及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)描繪了食管鱗狀上皮細胞癌癌組織與正常組織之間的差異蛋白質(zhì)譜，旨在鑒定到對食管鱗狀上皮細胞癌有診斷意義的免疫組化標(biāo)志物，以期提高早期診斷水平，進而改善患者預(yù)后。同時也為其發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制研究提供新的線索。

7、
　　 方法：
　　 分別在手術(shù)中標(biāo)本離體后收集5例食管鱗狀上皮細胞癌患者癌組織和遠端正常粘膜組織，蛋白提取后，分別將5例腫瘤樣本蛋白及5例正常粘膜樣本蛋白混合、胰酶消化后，以同位素相對與絕對定量試劑盒標(biāo)記腫瘤和正常組織蛋白，混合后首先用強陽離子交換進行第一維的分離，根據(jù)峰型和時間共收取20個梯度，然后采用反相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對樣品進行第二維的分離和蛋白質(zhì)多肽質(zhì)譜圖的獲取與定量，經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索，描繪出食管鱗狀上皮細胞癌組

8、織差異蛋白質(zhì)譜。搜索Swiss-Prot與GeneOntcology數(shù)據(jù)庫進行差異蛋白質(zhì)亞細胞定位和功能分析。
　　 經(jīng)生物信息學(xué)分析，在差異蛋白質(zhì)譜中挑選一組蛋白，以免疫組織化學(xué)法檢測其表達水平。收集57例食管鱗狀上皮細胞癌癌組織和遠端正常粘膜組織，經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋、切片后，脫蠟至水、高壓抗原修復(fù)、雙氧水封閉內(nèi)源性酶、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色及蘇木素復(fù)染后，采用雙盲法有兩位病理學(xué)醫(yī)師對結(jié)果進行診斷。診斷標(biāo)準(zhǔn)：在5

9、個視野觀察200個上皮細胞，對陽性細胞數(shù)和染色強度進行觀察并打分，兩者相加之和作為評分結(jié)果。根據(jù)陽性細胞百分比進行打分的標(biāo)準(zhǔn)：0,陰性；1，陽性細胞數(shù)<10％；2，陽性細胞數(shù)≥11％而<50％；3，陽性細胞數(shù)≥51％而<80％；4，陽性細胞數(shù)≥80％。根據(jù)染色強度進行打分的標(biāo)準(zhǔn)：0,無；1，弱陽；2，中等陽性；3，強陽性。
　　 另在手術(shù)中標(biāo)本離體后收集3例食管鱗狀上皮細胞癌患者癌組織和遠端正常粘膜組織，蛋白提與定量取后，采用W

10、estern－Blot實驗驗證差異蛋白的表達。取30微克總蛋白行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、一抗孵育、二抗孵育后以電化學(xué)發(fā)光法顯示條帶，以PDQUEST軟件半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 采用同位素相對與絕對定量、蛋白質(zhì)二維分離及質(zhì)譜技術(shù)描繪早期食管鱗狀上皮細胞癌組織蛋白譜，共鑒定到712個蛋白，其中，P<0.05并且在癌組織與正常組織中含量比值≧1.5或≦0.67的蛋白質(zhì)被認定為差異蛋白，共有39個蛋白(29個上調(diào)，10

11、個下調(diào))。利于Swiss-Prot和GeneOntcology數(shù)據(jù)庫搜索，差異蛋白定位于細胞膜、細胞外基質(zhì)、細胞漿和細胞核，其功能與結(jié)合、細胞結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)到、細胞粘附等相關(guān)。在這些差異蛋白質(zhì)中，我們選擇了TP-alpha(HADHA)，Collagenalpha－1(VI)chain(COL6A1)和S100A9等3個高表達蛋白質(zhì)進行免疫組化實驗，結(jié)果顯示：TP-alpha表達于77.19％腫瘤間質(zhì)，腫瘤細胞及正常粘膜上皮細胞中不表達；

12、Collagenalpha－1(VI)chain表達于細胞外和細胞膜，癌組織中85.96％％陽性，正常組織中31.58％陽性，與正常組織相比，75.44％表達增高。S100A9表達于細胞漿，在89.47％的腫瘤組織與66.67％正常組織中陽性，在癌組織中呈現(xiàn)局灶狀團簇狀表達，與正常組織相比，表達升高者占59.65％。通過收受者特征曲線的曲線下面積分析，分別以免疫組化評分(2、3、3分)作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，其診斷標(biāo)準(zhǔn)、靈敏度、特異度和曲線下面積

13、分別為：HADHA，≧2分，77.19％，100.00％和0.886％；COL6A1，≧3分，71.93％、85.96％和0.856％，和S100A9，≧3分，82.46％、43.86％和0.647％。Western-Blot實驗同樣證明了HADHA、COL6A1和S100A9在癌組織中的高表達。
　　 結(jié)論：
　　 我們初步描繪了食管鱗狀上皮細胞癌組織差異蛋白質(zhì)譜，為食管癌發(fā)生發(fā)展機制及腫瘤標(biāo)志物的研究提供新的線索。H