擬穴青蟹TRAF6調(diào)控抗脂多糖因子(ALFs)表達(dá)及參與免疫信號(hào)通路TLR-NF-κB的研究.pdf

1、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國東南沿海岸廣泛分布的一種重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蟹類。然而，細(xì)菌感染引發(fā)的疾病，嚴(yán)重影響青蟹養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。本課題組之前的研究表明：副溶血性弧菌（Vp）是引起汕頭牛田洋青蟹疾病爆發(fā)的最主要病原菌之一。因此，深入研究擬穴青蟹響應(yīng)副溶血性弧菌感染的先天性免疫防御的分子機(jī)制，對于控制青蟹疾病具有重要意義。本論文取得的主要結(jié)果如下：
　　1.論文首先研究了擬穴青蟹抗脂多糖因子5（SpALF5

2、）在青蟹免疫防御中的功能。進(jìn)一步研究6種SpALFs體內(nèi)表達(dá)的信號(hào)通路和信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因——腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。最后篩選與TRAF6相互作用的蛋白并探究調(diào)控TRAF6活性的機(jī)制。SpALF5的cDNA全長975bp，開放閱讀框（ORF）長375bp，共編碼125個(gè)氨基酸。組織特異性表達(dá)結(jié)果顯示：SpALF5在腦組織中表達(dá)量最高，其次是肌肉和內(nèi)皮組織，而在血細(xì)胞中表達(dá)量最低。組織原位雜交進(jìn)一步驗(yàn)證了SpALF5

3、mRNA在3種高表達(dá)組織中的轉(zhuǎn)錄水平。免疫應(yīng)激表達(dá)結(jié)果顯示：在注射應(yīng)激源后的不同時(shí)間段，SpALF5在體內(nèi)的表達(dá)水平顯著性上調(diào)。誘導(dǎo)表達(dá)并純化得到的rSpALF5蛋白約為32kDa(含Trx.Tag)，在體外對G-（Vp、溶藻弧菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌），真菌（釀酒酵母）及某些G+（金黃色葡萄球菌）具有較強(qiáng)的抗菌活性以及不同程度的黏附活性。以上結(jié)果表明：SpALF5是一種潛在的免疫因子并在青蟹抵抗病原菌感染中起重要的免疫防御作用。

4、r>　　2.為深入研究ALFs在青蟹體內(nèi)表達(dá)的信號(hào)通路，本論文研究了SpTRAF6基因在免疫信號(hào)通路中的功能。利用RNA干擾的方法敲低SpTRAF6的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)青蟹血淋巴的免疫清除能力顯著性減弱；干擾后再注射Vp或LPS，檢測SpALFs的表達(dá)，結(jié)果顯示6種ALFs的表達(dá)水平在血細(xì)胞和肝胰腺中出現(xiàn)不同程度的抑制，表明SpTRAF6可能通過TLR/NF-κB信號(hào)途徑調(diào)控這6種ALFs的表達(dá)。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告檢測，在果蠅（Dros

5、ophila melanogaster）S2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)SpTRAF6蛋白，檢測6種ALFs的啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄熒光素酶的活性，發(fā)現(xiàn)這六種ALFs啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄熒光素酶的活性被顯著性增強(qiáng)，說明SpTRAF6可通過TLR/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控SpALFs的表達(dá)。利用下拉（Pull-down）實(shí)驗(yàn)，體外證明了SpTRAF6可以與其上游蛋白SpPelle和下游的SpEcsit蛋白相互作用，發(fā)生互作的區(qū)域?yàn)椋篠pPelle的PAT1結(jié)構(gòu)域與SpTRA

6、F6的Ring/Zf-TRAFs結(jié)構(gòu)域，SpTRAF6的MATH結(jié)構(gòu)域與SpEcsit的ECSIT結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步利用Far-Western Blot技術(shù)驗(yàn)證了SpTRAF6與SpPelle，SpEcsit體外相互作用的關(guān)系。將這三種蛋白在果蠅S2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，通過免疫共沉淀（ Co-IP）實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證了SpTRAF6與SpPelle，SpEcsit相互結(jié)合的功能。以上結(jié)果表明，SpTRAF6參與了擬穴青蟹的免疫應(yīng)激反應(yīng)，且SpTRA

7、F6通過TLR/NF-κB信號(hào)通路參與調(diào)控SpALFs的表達(dá)。
　　3.為探索擬穴青蟹血細(xì)胞內(nèi)調(diào)控SpTRAF6蛋白活性的潛在互作蛋白，我們利用 Co-IP（或 Far-Western Blot）和高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）技術(shù)篩選到237（Co-IP）和137（Far-Western Blot）個(gè)潛在的互作蛋白。經(jīng)分析篩選，對得到的5種絲氨酸蛋白酶或酶樣蛋白非常感興趣，并推測其中的1種或多種絲氨酸蛋

8、白酶可能參與SpTRAF6蛋白活性的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)前期工作已經(jīng)從青蟹血細(xì)胞內(nèi)克隆到1種clip絲氨酸蛋白酶（Sp-cSP），并對其基因特征和體外生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明：Sp-cSP是一種潛在的免疫因子并在擬穴青蟹抵抗外原菌感染中起重要的免疫防御作用，但是否與SpTRAF6發(fā)生相互作用并調(diào)控其活性，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　綜合以上結(jié)果，SpALF5在擬穴青蟹抵抗病原菌感染中起重要的免疫防御作用，而SpTRAF6蛋白能通過TL