TLR9-NF-κB信號通路對胃癌轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的：本研究以體外培養(yǎng)的胃癌細胞MGC803和移植瘤小鼠為研究對象,觀察TLR9在胃癌細胞和裸鼠移植瘤組織中的表達。同時,利用TLR9的非特異性抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)對TLR9/NF-κB信號通路進行干預,觀察TLR9/NF-κB信號通路在胃癌細胞MGC803增殖、遷移以及對IL-6分泌的影響,以及與胃癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的細胞因子:基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)和環(huán)氧合酶-

2、2(cyclo-oxygenase-2,COX-2)mRNA表達情況,探討TLR9的表達及其介導的NF-κB信號通路在胃癌發(fā)生及進展中的作用機制,為胃癌建立新的、有效的臨床免疫治療提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：(1)體外培養(yǎng)胃癌細胞MGC803,免疫熒光法檢測TLR9在胃癌細胞MGC803中的表達。(2)CCK-8法測定TLR9抑制劑CQ對MGC803細胞增殖活性的影響。(3)ELISA方法觀察TLR9抑制劑CQ在不同時間段對M

3、GC803細胞釋放IL-6的影響。(4)采用細胞劃痕法檢測TLR9抑制劑CQ對MGC803細胞遷移能力的影響。(5)運用RT-PCR的方法檢測不同濃度TLR9抑制劑CQ作用胃癌細胞MGC803一段時間后對COX-2,MMP-2,MMP-7以及NF-κBp65mRNA表達的影響。(6)建立胃癌的移植瘤裸鼠模型,觀察TLR9抑制劑CQ對腫瘤大小及腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。(7)解剖移植瘤裸鼠脾臟與腫瘤組織,計算裸鼠的脾指數(shù),觀察免疫系統(tǒng)的變化。(8)

4、應用免疫組化的方法觀察TLR9抑制劑CQ對腫瘤組織TLR9的表達及組織結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：(1)胃癌細胞MGC803上有TLR9的表達,并且主要表達在細胞漿。(2)50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1的CQ均能抑制胃癌細胞MGC803的增殖,且呈時間和濃度依賴性(p<0.05)。(3)200μg·mL-1的CQ分別作用MGC803細胞24h,48h和72h后均可抑制IL-6的表達,而50μg·mL-1

5、和100μg·mL-1的CQ僅在作用MGC803細胞72h后方可抑制IL-6的表達,且差異具有顯著性(p<0.05)。(4)TLR9/NF-κB信號通路激動劑CpGODN能夠促進胃癌細胞MGC803的遷移(p<0.05),抑制劑CQ能夠抑制胃癌細胞MGC803的遷移,并且呈時間-濃度依賴性(p<0.05)。(5)TLR9/NF-κB信號通路激動劑CpGODN能夠促進胃癌細胞MGC803表達NF-κBp65mRNA,COX-2mRNA和M

6、MP-2mRNA,而抑制劑CQ能夠抑制此三者mRNA的表達,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。對于MMP-7mRNA來說,TLR9/NF-κB信號通路激動劑和中低濃度的抑制劑能夠促進mRNA的表達,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05);而高濃度的抑制劑對mRNA的表達與對照組相比沒有統(tǒng)計學意義。(6)在早期將TLR9/NF-κB信號通路抑制后可以抑制腫瘤的增長,而晚期則不能抑制腫瘤的增長;解剖移植瘤裸鼠后在癌細胞種植部位附近的淋巴結(jié)、肝、脾

7、中均未觀察到有癌細胞的轉(zhuǎn)移灶。(7)SP法檢測結(jié)果顯示TLR9/NF-κB信號通路的激動劑組和空白模型組的腫瘤組織中表達TLR9的陽性細胞數(shù)要高于抑制劑組,且差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),且激動劑組和空白模型組均可見明顯的壞死灶,而抑制劑組壞死灶要相對較小。
　　結(jié)論：(1)胃癌細胞MGC803表達TLR9。(2)TLR9/NF-κB信號通路參與了胃癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移。(3)抑制TLR9/NF-?B信號通路可能是胃癌免疫治療的