剛地弓形蟲RH株速殖子在鼠星形膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)的實驗觀察.pdf

1、目的：弓形蟲感染可引起多種組織器官的病變，其中危害最為嚴重的是弓形蟲穿越血腦屏障入侵人腦引起的弓形蟲腦炎。本實驗建立剛地弓形蟲RH株速殖子體外感染SD大鼠腦星形膠質(zhì)細胞的模型，研究自噬現(xiàn)象在弓形蟲速殖子入侵星形膠質(zhì)細胞過程中的作用，為探討弓形蟲速殖子感染腦非特異免疫細胞星形膠質(zhì)細胞的可能的機制提供基礎(chǔ)。
　　 方法：1.原代培養(yǎng)新生SD大鼠大腦皮質(zhì)混合膠質(zhì)細胞，經(jīng)振蕩的方法，得到純化的星形膠質(zhì)細胞，經(jīng)免疫組化鑒定細胞純度。

2、>　　 2.復(fù)蘇凍存的弓形蟲速殖子，腹腔感染昆明小鼠，待到小鼠出現(xiàn)感染癥狀，抽取腹腔液，觀察弓形蟲速殖子毒力情況，直到接種三代，收集弓形蟲速殖子。
　　 3.待星形膠質(zhì)細胞傳到第三代時，將其接種于預(yù)先放有玻片的培養(yǎng)皿中，等到細胞長滿培養(yǎng)皿的80％，弓形蟲RH株速殖子與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)，0.5～72h，Giemsa染色，觀察速殖子的增殖情況。
　　 4.將共培養(yǎng)的弓形蟲速殖子與星形膠質(zhì)細胞，放在活細胞工作站下，觀察RH

3、速殖子與星形膠質(zhì)細胞的作用方式。
　　 5.MDC染色，熒光顯微鏡下觀察0～48h內(nèi)，共培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)自噬囊泡的變化。
　　 結(jié)果：（1）星形膠質(zhì)細胞經(jīng)恒溫振蕩分離，傳至第三代，此時細胞成熟，狀態(tài)穩(wěn)定。并經(jīng)GFAP抗體對星形膠質(zhì)細胞鑒定，純度為95％以上。
　　 （2）速殖子可在昆明小鼠體內(nèi)傳代保種，每2～3天傳代1次。傳至第三代時，弓形蟲速殖子毒力完好。
　　 （3）弓形蟲速殖子與星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)

4、2h，有蟲體開始進入細胞；8h后進入細胞蟲體增多明顯；24h絕大多數(shù)蟲體已經(jīng)進入細胞；到48h，大多數(shù)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)可以看到蟲體形成的假包囊，包囊最初形成時蟲體呈菊花狀排列，然后以二分裂的方式增殖，逐漸形成成熟的包囊，等待突破細胞膜的時；72h大部分細胞已被蟲體漲破，大量蟲體從細胞中釋放，開始新的感染-假包囊-增殖-破膜的過程。經(jīng)過這一周期，蟲體可增殖10～20倍。
　　 （4）活細胞工作站下，觀察到首先弓形蟲速殖子以其側(cè)面與星

5、形膠質(zhì)細胞膜接觸，然后再以頂部鉆入，弓形蟲速殖子是主動入侵鼠星形膠質(zhì)細胞。
　　 （5）MDC染色，弓形蟲速殖子與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)1h，細胞內(nèi)開始出現(xiàn)點狀熒光顆粒；2h、4h、8h，細胞內(nèi)熒光顆粒逐漸增加，以8h最為顯著；在12h時，細胞內(nèi)熒光顆粒明顯減少，伴隨細胞出現(xiàn)損傷，但形態(tài)尚完整；蟲體感染細胞24h和48h時，細胞內(nèi)熒光顆粒幾乎消失，同時細胞被破壞。
　　 結(jié)論：建立了弓形蟲RH速殖子體外感染鼠星形膠質(zhì)細胞的模