動態(tài)觀察弓形蟲速殖子對小鼠小腸黏膜的粘附和侵入以及體內(nèi)移行過程.pdf

1、目的：本研究首先動態(tài)觀察弓形蟲速殖子對小鼠小腸黏膜組織尤其是小腸上皮細(xì)胞的粘附和侵入；然后觀察弓形蟲速殖子經(jīng)口感染后在小鼠體內(nèi)各主要臟器的移行和組織內(nèi)分布。探討弓形蟲經(jīng)口感染穿越小腸黏膜屏障及體內(nèi)播散的機(jī)制，以期加深對弓形蟲致病機(jī)制的理解，為弓形蟲黏膜疫苗抗感染機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，為預(yù)防和治療弓形蟲感染開拓新思路。 方法:本研究分三部分：第一部分：7～8周齡BALB/c小鼠30只隨機(jī)分為感染組和對照組。感染組小鼠每

2、只灌胃接種含2×104個(gè)弓形蟲速殖子的PBS0.2ml，對照組給予等量的PBS。分別于感染后15min、30min、1h、2h、4h和8h處死感染組小鼠4只和對照組小鼠1只，取十二指腸、空腸、回腸制備石蠟切片，RNA原位雜交。 第二部分：將弓形蟲速殖子和IEC-6于24孔培養(yǎng)板內(nèi)蓋玻片上共培養(yǎng)，倒置顯微鏡動態(tài)觀察速殖子的黏附、侵入和增殖過程。分別于共培養(yǎng)5min、10min、20min、30min、1h、2h、4h、6h、12h

3、、24h、48h后取出蓋玻片，姬-瑞氏染色，光鏡觀察侵入、增殖情況，并計(jì)數(shù)侵入率。 第三部分：7～8周齡BALB/c小鼠30只隨機(jī)分為感染組和對照組。感染組小鼠每只灌胃感染含2×104個(gè)弓形蟲速殖子的PBS 0.2ml，對照組用等量的PBS灌胃。分別于灌胃后1d、2d、4d、6d和8d處死感染組小鼠4只和對照組小鼠1只，取腸系膜淋巴結(jié)(MLN)、肝、脾、肺和腦組織，制各石蠟切片，采用地高辛標(biāo)記的弓形蟲速殖子SAG2 mRNA特異

4、性寡核苷酸探針，進(jìn)行RNA原位雜交檢測速殖子在組織內(nèi)的分布。 結(jié)果:經(jīng)口感染后15min，速殖子到達(dá)小腸組織，速殖子可位于小腸上皮細(xì)胞(吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞)的紋狀緣，吸收細(xì)胞胞漿內(nèi)或相鄰吸收細(xì)胞之間及固有層內(nèi)。感染后15min～2h，粘附于空腸的速殖子數(shù)顯著高于回腸(P<0.05)；感染后15和30min，侵入空腸的速殖子數(shù)顯著高于十二指腸和回腸(P<0.05)。隨著感染后時(shí)間的延長，速殖子粘附于各腸段的數(shù)量逐漸減少

5、，侵入的數(shù)量逐漸增多。較感染后15min，8h所有腸段粘附的速殖子數(shù)顯著減少(P<0.05)，而4h和8h侵入的數(shù)量顯著增加(P<0.05)。感染后8h侵入空腸和回腸的數(shù)量顯著高于4h(P<0.05)。 體外細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示：共培養(yǎng)5min弓形蟲速殖子既可侵入IEC-6細(xì)胞，侵入率逐漸升高，1h為55.00％±6.59，胞內(nèi)蟲體數(shù)量為1～5個(gè)；2h侵入率最高，達(dá)81.80％±10.16，同時(shí)有假包囊的形成，4h假包囊破裂，釋放

6、出速殖子；48h無貼壁細(xì)胞存在，有大量游離速殖子。 經(jīng)口感染后1d，速殖子出現(xiàn)于MLN、肝、脾組織內(nèi)；感染后2d，MLN、肝、脾組織內(nèi)的速殖子形成假包囊；感染后4d速殖子可見于肺內(nèi)；感染后6d，速殖子移行至腦組織，于腦組織內(nèi)偶見假包囊。感染早期，MLN、肝、脾組織血管及淋巴管周圍可見少量蟲體，隨后，蟲體分布于整個(gè)MLN、肝、脾及肺內(nèi)。隨著感染時(shí)間的推移，MLN、肝、脾、肺和腦組織內(nèi)的蟲荷均顯著增加(P<0.05)。感染后第6d及

7、8d，組織內(nèi)蟲荷順序?yàn)椋篗LN>肝>脾>肺>腦。 結(jié)論:感染后15min，速殖子已粘附和侵入小腸黏膜，粘附無細(xì)胞選擇性，而侵入具有部位選擇性，空腸為速殖子的易感部位。感染后8h小腸固有層內(nèi)大量的速殖子可能是由于增殖所致。IEC-6是弓形蟲的適宜靶細(xì)胞，速殖子在體外可迅速侵入IEC-6細(xì)胞，并可在細(xì)胞內(nèi)增殖，增殖周期為6～12h。經(jīng)口感染后，弓形蟲速殖子穿越小腸黏膜屏障，首先侵入MLN，提示其可由小腸經(jīng)淋巴循環(huán)播散至其他臟器；速殖