弓形蟲緩殖子期特異抗原BSR4的克隆、表達(dá)、純化與鑒定.pdf

1、目的：從弓形蟲Prugniaud（PRU）株總DNA中克隆BSR4基因片段，構(gòu)建pET28a(+)-BSR4重組表達(dá)質(zhì)粒；對(duì)比不同蟲株之間BSR4基因序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析；在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)BSR4，純化表達(dá)產(chǎn)物并檢測其免疫反應(yīng)性，為弓形蟲病的免疫診斷和疫苗研制以及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：用本實(shí)驗(yàn)室保種的弓形蟲PRU株腹腔接種昆明鼠，取腦組織勻漿，用小鼠淋巴細(xì)胞分離液純化弓形蟲包囊，提取弓形蟲PRU株的基因組DN

2、A，根據(jù)GenBank中已知弓形蟲ME49株BSR4基因序列設(shè)計(jì)合成引物，在引物中引入NcoI和HindⅢ酶切位點(diǎn)。應(yīng)用PCR技術(shù)從弓形蟲PRU株基因組DNA中擴(kuò)增BSR4基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ切下目的片段，以相同的酶切位點(diǎn)通過T4連接酶亞克隆入pET28a(+)載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-BSR4，采用雙酶切及測序方法鑒定重組質(zhì)粒。采用生物信息學(xué)方法對(duì)BSR4蛋白的理化性質(zhì)、同源

3、性分析以及二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位進(jìn)行預(yù)測。將重組質(zhì)粒pET28a(+)-BSR4轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中，挑取單個(gè)菌落，培養(yǎng)擴(kuò)增至OD600約為0.5，加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破壁后，分離上清和沉淀，SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)沉淀中的包涵體經(jīng)8M尿素溶解，His Trap Ni親和層析柱純化重組蛋白， Western-Blottting鑒定重組BSR4蛋白的免疫反應(yīng)性。改良Bradford(考馬斯亮藍(lán))法測定純化蛋白濃

4、度。用小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離感染及未感染弓形蟲小鼠脾細(xì)胞，以純化抗原刺激小鼠脾細(xì)胞的生長，48h后加入3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測小鼠脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖水平。
　　結(jié)果： PCR體外擴(kuò)增得到目的基因片段長約1194 bp，測序結(jié)果表明，獲得弓形蟲BSR4基因片段。經(jīng)BLAST同源性對(duì)比顯示，弓形蟲PRU株和ME49株基因序列同源性為100％，是高度保守的序列。雙酶切及測序結(jié)果顯示目的基因己被正確地連接入重組質(zhì)粒pET28a

5、(+)中。生物信息學(xué)分析表明，BSR4蛋白相對(duì)分子量為42344.75，有2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，氨基酸序列的前40位為信號(hào)肽序列，N端為信號(hào)肽，C端為疏水序列，預(yù)測它為糖基磷脂酰肌醇固著蛋白,存在18個(gè)潛在抗原表位及2個(gè)保守功能區(qū)域。重組質(zhì)粒pET28a(+)-BSR4經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸埃希菌BL21(DE3)中表達(dá)，超聲破菌后SDS-PAGE電泳分析取上清和沉淀，結(jié)果表明重組蛋白在37℃時(shí)大量表達(dá)，以包涵體的形式存在。表達(dá)蛋白經(jīng)尿素溶解，

6、His Trap Ni親和層析柱純化，得到可溶性蛋白。Western-blotting檢測可發(fā)現(xiàn)一特異性蛋白區(qū)帶，分子量約為45 kDa，該條帶能被弓形蟲慢性感染血清識(shí)別。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，感染弓形蟲小鼠刺激指數(shù)（SI）明顯高于未感染組。
　　結(jié)論：從弓形蟲PRU株中克隆出緩殖子期特異性抗原BSR4基因編碼序列；成功構(gòu)建了目的基因BSR4的重組質(zhì)粒pET28a(+)-BSR4，在大腸埃希菌BL21中以包涵體形式高效表達(dá)了BSR