弓形蟲RH株脯氨酰氨氨基肽酶特征與功能性研究.pdf

1、弓形蟲病是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）寄生而引起的一種世界性分布的人獸共患原蟲病，弓形蟲屬頂端復(fù)合物亞門（Subphylum Apicomplexa），肉孢子蟲科(Sporozoasida)，真球蟲目(Eucoccidiorida)，細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲，在人畜和溫血野生動物中廣泛傳播，呈全球性分布。血清學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，全世界約有25％的人群受到弓形蟲的感染。弓形蟲病嚴(yán)重威脅著人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展，同時(shí)該病是造成器官

2、移植，免疫功能受損，艾滋病死亡的一個(gè)重要并發(fā)病，更重要的它也是影響嬰兒先天畸形、缺陷、智力低下、死胎、早產(chǎn)的重要病原體之一。目前尚無針對弓形蟲病感染的有效治療藥物，且藥物種類相對較少，大多數(shù)藥物并不能徹底清除病原感染，只能使患者恢復(fù)到隱性感染狀態(tài)。所以迫切需要加快對新藥的研究開發(fā)。氨基肽酶作為一種蛋白酶在蛋白質(zhì)成熟、多肽降解和蛋白質(zhì)穩(wěn)定等方面有著關(guān)鍵性作用。很多腫瘤細(xì)胞或者病原微生物編碼的氨基肽酶已經(jīng)被鑒定為藥物靶點(diǎn)。目前對弓形蟲氨基肽

3、酶的研究方面報(bào)道較少。本研究將通過生物信息學(xué)和基因工程學(xué)鑒定弓形蟲脯氨酰氨基肽酶基因，通過分子生物學(xué)和酶動力學(xué)體外重組表達(dá)脯氨酰氨基肽酶分析生物化學(xué)活性;通過細(xì)胞生物學(xué)和免疫生物學(xué)對弓形蟲脯氨酰氨基肽酶在蟲體細(xì)胞內(nèi)生長發(fā)育功能進(jìn)行初步解析，進(jìn)一步評價(jià)脯氨酰氨基肽酶作為弓形蟲藥物靶點(diǎn)的可行性，從而豐富弓形蟲氨基肽酶基礎(chǔ)理論知識，填補(bǔ)弓形蟲脯氨酰氨基肽酶研究空白，為今后防治弓形蟲感染有效的疫苗和藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。主要內(nèi)容如下:
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4、.弓形蟲APP基因DNA克隆及生物信息學(xué)分析
　　參照ToxoDB(www.ToxoDB.org)數(shù)據(jù)庫上提供的弓形蟲APP基因序列，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，提取弓形蟲RH強(qiáng)毒株的RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過PCR方法擴(kuò)增APP目的基因，將目的片段克隆連接到pMD18-T載體上，測序結(jié)果與Genebank發(fā)表的序列進(jìn)行比對同源性為100％。序列分析表明弓形蟲與其他寄生性原蟲APP氨基酸序列同源性較高，與新孢子蟲氨基酸同源性為34

5、％;與隱孢子蟲、艾美爾球蟲氨基酸同源性為41％;與巴貝斯蟲、瘧原蟲氨基酸同源性分別為32％;與利什曼原蟲、錐蟲氨基酸同源性最低36％;進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示弓形蟲與哺乳動物APP親緣關(guān)系遠(yuǎn)，從序列水平分析APP具備作為弓形蟲病藥物治療靶位點(diǎn)的條件。理化性質(zhì)分析TgAPP蛋白分子質(zhì)量為78829.1kDa，由724個(gè)氨基酸組成。預(yù)測的等電點(diǎn)5.88，堿性氨基酸殘基總為68％，酸性氨基酸殘基為80％，其中碳原子含有3488、氫原子5496、氮原

6、子978、氧原子1066、硫原子20;總的原子數(shù)為11048。蛋白水中的消光系數(shù)90465M-1 cm-1。在哺乳動物、酵母、大腸桿菌中半衰期為30、20、20。不穩(wěn)定指數(shù)為42.78％。脂溶性指數(shù)為86.24％，蛋白親水性為-0.232。亞細(xì)胞定位分析TgAPP蛋白主要分布在細(xì)胞包漿中約為65.2％，細(xì)胞核約為21.7％、線粒體為13％。同時(shí)運(yùn)用生物軟件對APP蛋白結(jié)構(gòu)域、功能區(qū)、信號肽等位置進(jìn)行預(yù)測，根據(jù)分析提供的信息及當(dāng)前APP基

7、因的研究進(jìn)展，模擬建立APP基因蛋白空間結(jié)構(gòu)。通過對弓形蟲APP基因生物信息學(xué)分析從而為下一階段了解APP蛋白功能研究奠定了重要的基礎(chǔ)。
　　2.弓形蟲APP基因細(xì)胞定位研究
　　APP蛋白酶廣泛存在于低等到高等生物體中，APP對蛋白成熟以及在細(xì)胞中的分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、功能調(diào)節(jié)極其重要。為了進(jìn)一步研究APP蛋白的細(xì)胞定位，構(gòu)建了pGCD質(zhì)粒在蟲體核內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)。在pSAG1∷CAS9-U6∷sgUPRT載體上

8、通過限制性酶切位點(diǎn)Pmel插入弓形蟲U6啟動子序列，在弓形蟲U6啟動子序列KpnⅠ位點(diǎn)插入DHFR藥物篩選靶點(diǎn)，通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法觀察APP蛋白主要存在蟲體細(xì)胞質(zhì)中，與亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果相同，APP蛋白可能參與蛋白多肽轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　3.弓形蟲APP原核表達(dá)和真核表達(dá)
　　通過RT-PCR方法克隆APP基因cDNA，插入含有GST標(biāo)簽的pColdTMⅢ載體進(jìn)行原核表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)重組載體pCold-Ⅲ-TgAPP蛋白表達(dá)

9、，經(jīng)SDS-PAGE分析，重組APP分子質(zhì)量為105kDa。經(jīng)GST樹脂純化，重組濃度達(dá)到2mg/ml。將純化出的重組蛋白rTgAPP免疫ICR小鼠，制備多克隆抗體;三次免疫過后通過ELISA方法檢測小鼠血清效價(jià)達(dá)1∶5000，具有很好的反應(yīng)原性，超聲破碎弓形蟲提取蛋白上清混合液，通過Western blot檢測，內(nèi)源性抗原在速殖子階段大小為78kDa和預(yù)測蛋白大小一致。為了驗(yàn)證APP基因是否能表達(dá)在真核表達(dá)系統(tǒng)，APP基因重組桿狀病毒

10、在昆蟲細(xì)胞表達(dá)，Western blot檢測APP蛋白能在昆蟲細(xì)胞表達(dá)。
　　4.重組APP蛋白酶活性檢測和酶動力學(xué)分析
　　氨基肽酶P是外肽酶的一種，從多肽氨基端倒數(shù)第二位置特定水解脯氨酰氨基釋放游離氨基酸從而保護(hù)不被其他氨基酸水解，酶促反應(yīng)活力可受多種因素的調(diào)節(jié)，包括不同離子濃度、溫度、化學(xué)環(huán)境（如pH值）、底物濃度、以及抑制劑等。為了研究rTgAPP酶的活性和動力學(xué)參數(shù)，通過添加特異性底物L(fēng)ys(Abz)-Pro-Pr

11、o-NA，重組后的rTgAPP蛋白酶在37℃具有強(qiáng)烈的反應(yīng)活性，最適合的反應(yīng)pH值為8.0，在二價(jià)Mn2+存在下rTgAPP蛋白酶催化活性明顯增強(qiáng)，rTgAPP活性受苯丁抑制素和EDTA抑制劑影響，酶動力學(xué)分析rTgAPP催化效率達(dá)到139.6×105M-1s-1，rTgAPP蛋白酶米氏常數(shù)Km為0.255μM，動力學(xué)常數(shù)kcat為35.6 s-1。結(jié)果表明重組rTgAPP具有良好的催化活性和反應(yīng)活性。
　　5.弓形蟲APP缺失株

12、構(gòu)建
　　弓形蟲APP缺失株構(gòu)建通過CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)，PCR方法擴(kuò)增pGCD載體Pmel酶切位點(diǎn)兩邊序列為同源臂，通過Overlap PCR方法連接敲除序列g(shù)RNA，同源重組連入pGCD載體，pGCD-TgAPP質(zhì)粒以GFP為篩選標(biāo)記，電穿孔轉(zhuǎn)染弓形蟲，乙胺胺嘧啶作為篩選藥物，經(jīng)96孔板限制性稀釋獲得單克隆抗性敲除蟲株。設(shè)計(jì)引物PCR方法進(jìn)行基因水平鑒定，然后通過rTgAPP多克隆抗體經(jīng)Western blot在

13、蛋白水平上進(jìn)一步鑒定，最后通過酶促反應(yīng)蛋白水解特異性底物鑒定，從而獲得ATgAPP基因缺失蟲株。
　　6.弓形蟲APP基因功能初步研究
　　由于弓形蟲編碼的氨基肽酶和宿主相關(guān)酶類的序列之間有很大差異，通?？梢宰鳛楹Y選抗弓形蟲藥物的潛在靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步深入理解弓形蟲編碼的氨基肽酶P的功能特性，通過納蟲空泡計(jì)數(shù)觀察、流式細(xì)胞檢測、酶底物活性分析、及噬斑等方法對弓形蟲APP基因缺失蟲株黏附、侵入、增殖、底物代謝能力進(jìn)行研究，從而鑒

14、定APP基因的缺失是否對弓形蟲生物功能有所影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺失了APP基因蟲株(ΔTgAPP)在黏附、侵入速度方面明顯慢于野生株，從而證明APP基因的表達(dá)影響弓形蟲黏附、侵入。流式細(xì)胞檢測細(xì)胞包含蟲體GFP熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示APP基因缺失株在2h、24h、72h不同時(shí)間區(qū)間熒光強(qiáng)度低于野生蟲株，統(tǒng)計(jì)分析差異顯著(P＜0.05)，結(jié)果說明APP基因缺失導(dǎo)致蟲體在增殖方面受到阻礙。酶底物活性顯示APP基因缺失株與野生株相比水解特定底物能力