深低溫凍存對(duì)不同培養(yǎng)條件下的HUVEC生物特性的影響.pdf

1、目的:
　　 1.探討深低溫凍存對(duì)HUVEC存活率、生長(zhǎng)增殖活力、凋亡、免疫原性等生物特性的影響。
　　 2.探討ZVAD-fmk和VEGF在深低溫凍存時(shí)對(duì)HUVEC的保護(hù)作用,為如何提高臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞庫(kù)中細(xì)胞活力和活細(xì)胞的數(shù)量指出具體步驟,提高構(gòu)建理想組織工程血管的成功率。
　　 3.探討體外培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)HUVEC生長(zhǎng)增殖活力、凋亡及免疫原性的影響,為制定HUVEC作為種子細(xì)胞的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

2、>　　 方法:
　　 1.將HUVEC分成4組,其中一組為新鮮組,其余3組應(yīng)用程序降溫法分別深低溫凍存24小時(shí)、2月、4月,并按規(guī)定凍存時(shí)間復(fù)蘇。以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率,繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活力,Hoechest染色觀察細(xì)胞凋亡,流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性及免疫原性變化,并與新鮮組比較。
　　 2.將HUVEC分成4組,在4組凍存液中分別加入0、10umol/L、20umol/L、30umo

3、l/LCaspase抑制劑ZVAD-fmk,應(yīng)用程序降溫法深低溫凍存2月后復(fù)蘇。以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率,繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)觀察細(xì)胞活力,Hoechest染色觀察細(xì)胞凋亡,流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性。
　　 3.將HUVEC分成4組,在4組凍存液中分別加入0、25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),應(yīng)用程序降溫法深低溫凍存2月后復(fù)蘇。以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率,繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)觀察細(xì)胞

4、活力,Hoechest染色觀察細(xì)胞凋亡,流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性。
　　 4.將從臍靜脈內(nèi)消化下來(lái)的原代HUVEC分成4組,分別培養(yǎng)6、10、14、18天,消化后以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率,繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)觀察細(xì)胞活力,Hoechest染色觀察細(xì)胞凋亡,流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性及免疫原性,并將各組細(xì)胞分別深低溫凍存2月后復(fù)蘇,檢測(cè)細(xì)胞存活率、凋亡率及Caspase-3活性。
　　 結(jié)果:<

5、br>　　 1.新鮮組及深低溫凍存24小時(shí)、2月、4月組HUVEC復(fù)蘇后的存活率分別為97.38±1.22％、93.00±2.74％、88.88±3.89％、85.50±3.57％,早期凋亡率分別為1.26±0.72％、1.57±0.86％、2.46±0.92％、3.43±1.02％,Caspase-3活性分別為21.85±6.40％、27.71±6.79％、39.89±8.09％、48.04±7.53％,各組比較均有顯著差異(P<0

6、.05)。Hoechst染色證實(shí)了凋亡及凋亡所致的細(xì)胞壞死；各組生長(zhǎng)曲線(xiàn)相似,凍存組細(xì)胞增殖速率較新鮮組有所減慢。HLA-ABC、HLA-DR的表達(dá)在凍存前后無(wú)顯著變化。
　　 2.不同濃度(0、10、20、30umol/L)ZVAD-fmk組HUVEC經(jīng)深低溫凍存2月復(fù)蘇后的存活率分別為88.90±3.39％、91.00±3.29％、91.90±2.51％、90.70±1.95％,早期凋亡率分別為2.34.±0.88％、1.8

7、8±0.87％、1.82±0.80％、2.03±0.83％,Caspase-3活性分別為39.40±7.18％、36.45±6.43％、34.76±6.38％、34.74±6.90％,各濃度ZVAD-fmk組與對(duì)照組(0umol/L組)比較,存活率均有升高,凋亡率和Caspase-3活性均有下降,且有顯著差異(P<0.05)。Hoechst染色發(fā)現(xiàn)4個(gè)組內(nèi)均見(jiàn)少量凋亡及壞死細(xì)胞,各組間無(wú)明顯差別；各組生長(zhǎng)曲線(xiàn)相似,ZVAD-fmk濃度為

8、20umol/L組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力最強(qiáng)。
　　 3.不同濃度(0、25、50、75ng/ml)VEGF組HUVEC經(jīng)深低溫凍存2月復(fù)蘇后的存活率、早期凋亡率、Caspase-3活性相互比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)。Hoechst染色均可見(jiàn)少量凋亡及壞死細(xì)胞,各組間無(wú)明顯差異。
　　 4.不同培養(yǎng)時(shí)間(6、10、14、18天)組的HUVEC凍存前存活率分別為98.00±0.87％、96.88±1.36％、95.00±1

9、.50％、93.38±1.87％,早期凋亡率分別為0.75±0.13％、1.37±0.42％、2.63±1.01％、4.23±1.53％,Caspase-3活性分別為18.53±2.10％、21.98±1.71％、27.63±2.71％、36.13±5.53％,各培養(yǎng)時(shí)間組之間相比較,6天組與10天組無(wú)顯著差異(P>0.05),其余組間比較均有顯著差異(P<0.05)。不同培養(yǎng)時(shí)間組間的HLA-ABC、HLA-DR的表達(dá)均無(wú)顯著差異(P

10、>0.05)。Hoechst染色發(fā)現(xiàn)14、18天組內(nèi)可見(jiàn)少量凋亡及壞死細(xì)胞。從各組生長(zhǎng)曲線(xiàn)可以看出,6天、10天組HUVEC增殖活躍,而14天和18天組增殖活力較低。4個(gè)培養(yǎng)時(shí)間組細(xì)胞經(jīng)深低溫凍存2月后,其存活率均較新鮮組下降,早期凋亡率和Caspase-3活性均較新鮮組增高,有顯著差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究發(fā)現(xiàn)深低溫凍存減弱了HUVEC生長(zhǎng)增殖能力,并誘導(dǎo)了HUVEC凋亡,且凋亡率隨凍存時(shí)間