HUVEC原代培養(yǎng)及深低溫凍存復蘇對其免疫原性影響的實驗研究.pdf

1、目的： 1、人臍靜脈血管內皮細胞體外分離、原代培養(yǎng)，并予以鑒定及凍存復蘇，構建臍靜脈細胞庫，為構建組織工程血管提供種子細胞。 2、初步探討深低溫凍存對人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）免疫原性影響，為研究深低溫凍存對血管等組織保存的免疫原性影響提供基礎理論依據(jù)。 方法： 1、利用0.1%膠原酶消化、分離、體外原代培養(yǎng)臍靜脈血.管內皮細胞，0.125%胰酶-0.02%EDTA溶液消化傳代，根據(jù)細胞特有的形態(tài)

2、學特征和Ⅷ因子、CD31、CD34細胞免疫組化及對乙?；疞DL高攝取試驗進行內皮細胞鑒定。 2、采用含10%DMSO凍存液分別應用常規(guī)梯度降溫及程序降溫盒進行凍存2周，37℃水浴快速復溫來復蘇，觀察冷凍前后細胞形態(tài)，計數(shù)培養(yǎng)凍存前后細胞數(shù)量，繪制凍存前后細胞生長曲線，探索深低溫凍存及復蘇人臍靜脈血管內皮細胞較佳方法。 3、單向混合人淋巴細胞-臍靜脈血管內皮細胞培養(yǎng)，即使用1×106/mlPBMC和1×105/ml滅活HU

3、VEC共同培養(yǎng)72小時，加入MTT法，酶聯(lián)免疫板檢測570nm處吸光度，判斷凍存復蘇前后血管內皮細胞對人PBMC增值情況。 4、流式細胞儀檢測新鮮和凍存復蘇2周后細胞HLA-ABC及HLA-DR抗原的表達，檢測其HLA-ABC及HLA-DR抗原的表達變化，判斷其免疫原性的強弱。 5、并利用不同濃度（0，50U/ml，100 U/ml，200 U/ml，300 U/ml，400 U/ml）IFN-γ誘導培養(yǎng)凍存及新鮮的血管

4、內皮細胞，流式細胞儀檢測新鮮和凍存復蘇后細胞HLA-ABC及HLA-DR抗原的表達，判斷在模擬體內炎癥環(huán)境中新鮮和凍存血管內皮細胞免疫原性的強弱。 結果： 1、人臍靜脈血管內皮細胞的體外原代培養(yǎng)、傳代生長均良好，呈典型的鋪路石樣形態(tài)學表現(xiàn)，Ⅷ因子、CD31、CD34細胞免疫組化顯示早陽性反應，及Dil-Ac-LDL攝取熒光檢測提示其具有強攝取能力，從而鑒定為血管內皮細胞。 2、臺盼藍據(jù)染結果表明利用程序降溫盒凍存

5、復蘇的細胞活性為88±5.3%，普通的梯度凍存復蘇存活率為75.8±8.1%，與程序降溫盒凍存細胞存活率有顯著差別（P<0.05）。新鮮與深低溫凍存的血管內皮細胞形態(tài)類似，生長增值情況良好，生長曲線類似，未見明顯差別（P>0.05）。 3、單向混合淋巴細胞-血管內皮細胞培養(yǎng)；MTT結果顯示新鮮組血管內皮細胞對人外周血淋巴細胞刺激指數(shù)為1.716±0.181，凍存組血管內皮細胞對人外周血淋巴細胞刺激指數(shù)為1.686±0.145，兩

6、者對外周血淋巴細胞刺激無顯著差別（P>0.05）。 4、新鮮和深低溫凍存復蘇的臍靜脈血管內皮細胞均表達HLA-ABC抗原，而不表達HLA-DR抗原，HLA-ABC抗原表達率（96.55±1.88 vs95.98±1.4）和平均表達強度（84.13±5.73 vs82.36±4.75）均未見明顯差別（P>0.05）； 5、通過不同濃度IFN-γ誘導培養(yǎng)后，HLA-ABC抗原的平均表達強度增強，HLA-DR抗原的平均表達強度

7、和表達率逐漸加強，且呈劑量依賴性，HLA-ABC抗原平均表達強度新鮮組和凍存組未見明顯差別，但新鮮組中HLA-DR抗原的表達率和平均表達強度均高于凍存組（P<0.01）。 結論： 1、通過本研究，建立了一整套的人臍靜脈血管內皮細胞原代分離、培養(yǎng)、傳代及凍存復蘇方法，并通過鑒定，可以初步構建臍靜脈血管內皮細胞庫，為血管內皮細胞的研究提供平臺。 2、在無或低（IFN-γ≤50u/ml）免疫炎癥環(huán)境下，深低溫凍存復蘇2