二元信號系統(tǒng)ComD-ComE與肺炎鏈球?qū)Ζ?內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的相關(guān)性.pdf

1、目的:構(gòu)建肺炎鏈球菌調(diào)控感受態(tài)形成的二元信號傳導(dǎo)系統(tǒng)(TCS)基因comD/comE/comC的原核表達(dá)系統(tǒng),探討ComD和ComC封閉后細(xì)菌耐藥性變化。建立肺炎鏈球菌comD基因敲除突變株,了解comD基因與細(xì)菌β-內(nèi)酰類抗生素耐藥性的相關(guān)性,探討氯氰碘柳胺下調(diào)comD、comE和comC基因mRNA的作用。
　　 方法:采用PCR擴(kuò)增全長comD、comE和comC基因,并用常規(guī)基因工程技術(shù)建立其原核表達(dá)系統(tǒng)。采用SDS-P

2、AGE及Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢測目的重組蛋白rComD、rComE和rComC表達(dá)量。免疫家兔制備rComD、rComE和rComC抗血清。檢測肺炎鏈球菌菌株ComD和ComC被抗血清封閉后對青霉素和頭孢胺噻耐藥性的變化。構(gòu)建用于comD基因敲除的自殺質(zhì)粒pEVP3comD,通過同源重組及插入失活獲得肺炎鏈球菌ATCC6306株comD基因敲除突變株coreD-。采用PCR及免疫熒光法對comD-突變株進(jìn)行鑒定。采用實時熒光定

3、量RT-PCR檢測氯氰碘柳胺處理前后comD-突變株及野生株comD、comE和comC基因mRNA水平變化。采用二倍瓊脂稀釋法測定comD-突變株及野生株對青霉素G和頭孢噻肟的敏感性。
　　 結(jié)果:與報道序列比較,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為98.4％～99.3％和99.1％～100％。所構(gòu)建的工程菌E.coliBL21DE3pET42a-comD、E.coliBL21DE3pET42

4、-comE和E.coliBL21DE3pET32a-comC能有效表達(dá)目的重組蛋白rComD、rComE和rComC,其產(chǎn)量分別為細(xì)菌總蛋白的28％、25％和35％。rComD、rComE和rComC抗血清免疫雙擴(kuò)散效價分別為1:4、1:4和1:8。ComD和/或ComC被抗血清封閉后,頭孢胺噻敏感菌株可出現(xiàn)耐藥性,但耐藥菌株耐藥性無明顯改變,也不影響各菌株對青霉素的耐藥性。測序及免疫熒光試驗結(jié)果證實,所構(gòu)建的comD-突變株染色體DN

5、A中comD基因被插入失活。50μmol/L或100μmol/L的氯氰碘柳胺能明顯下調(diào)comD、comE和comC基因mRNA水平(P＜0.05),25μmol/L的氯氰碘柳胺則否。comD-突變株對青霉素及頭孢噻肟MIC值均為32μg/mL,明顯高于野生株的0.06和1μg/mL。
　　 結(jié)論:本研究成功地構(gòu)建了肺炎鏈球菌comD/come/comC基因原核表達(dá)系統(tǒng),為深入研究感受態(tài)形成相關(guān)TCS與耐藥性關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。Com