細(xì)菌耐藥相關(guān)基因型及二元信號與β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥關(guān)系研究.pdf

1、第一部分：我國東部地區(qū)淋病奈瑟菌臨床菌株porB基因分型與耐藥相關(guān)性研究
　　 背景：淋病奈瑟菌感染引起的淋病不僅是我國發(fā)病率最高的性傳播性疾病(STD)，也是嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題。淋病奈瑟菌多種外膜蛋白在細(xì)胞膜上形成孔道，又稱孔蛋白(Porin，Por)。其中PorB占細(xì)菌外膜蛋白總量的60％以上，根據(jù)PorB免疫原性的差異，可分為PorB1A和PorB1B兩類，其氨基酸序列相似性為65％～80％。PorB1A和Porb1

2、B由一個(gè)等位基因編碼，故一株淋病奈瑟菌僅含有porB1A或porB1B等位基因中的一種。國外文獻(xiàn)報(bào)告，分別有10％～30％和70%～90％淋病奈瑟菌臨床菌株分別表達(dá)PorB1A或PorB1B。采用單克隆抗體均可將PorB1A或PorB1B分為若干血清型，其中porB1B基因遺傳多樣性和重組變異率明顯高于porB1A基因，且不同地區(qū)優(yōu)勢流行的porB1A和porB1B基因型有明顯差異。近年文獻(xiàn)報(bào)道，PorB1B分子中第120和121位氨基

3、酸殘基G120D/K/R/P和/或A121D/H/P變異，與淋病奈瑟菌對青霉素和四環(huán)素耐藥性增高相關(guān)，但PorB1A分子中第120和121位氨基酸替換突變與細(xì)菌對兩種抗生素的耐藥性關(guān)系不大，因此確定不同地區(qū)淋病奈瑟菌臨床菌株外膜蛋白PorB編碼基因變異程度及其優(yōu)勢基因型分布具有現(xiàn)實(shí)意義，但國內(nèi)未有類似研究報(bào)道。
　　 方法：采用紙片酸度定量法測定菌株的β-內(nèi)酰胺酶，篩選出β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果陰性即不產(chǎn)青霉素酶淋病奈瑟菌臨床菌株。

4、以淋病奈瑟菌臨床菌株porB全基因核苷酸序列測定為基礎(chǔ)建立多重PCR(mPCR)用于對淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB編碼等位基因porB分型，對倍稀釋法檢測淋病奈瑟菌臨床菌株對青霉素和四環(huán)素的藥物敏感性。
　　 結(jié)果：315株臨床菌株中檢出porB1A基因型98株(31.1％)、porB1B基因型217株(68.9％)。98株porB1A基因型菌株血清型均為IA6，porB1A+菌株中88.8％不發(fā)生120和121位氨基酸突變，11

5、.2％發(fā)生D120G突變，且所有98株菌株對青霉素和四環(huán)素均敏感。217株帶有porB1B基因菌株中，分別有26.7％(58/217)、22.6％(49/217)和11.5％(25/217)屬IB3、IB3/6和IB4血清型；有35.5％(77/217)5’端與IB3/6相似，3’端與IB2相似，屬IB3/6-IB2嵌合血清型，且其中有15株第121和122位氨基酸缺失；另有3.7％(8/217)5’和3’端序列類似IB2血清型，中間序

6、列類似IB4血清型。212株(97.7％)porB1B基因編碼的氨基酸序列發(fā)生120和/或121突變，其中163株(76.9％)為雙突變。尤其是77株porB1B+IB3/6-IB2血清型臨床菌株有15株發(fā)生A121和N122刪除突變。上述所有發(fā)生突變212株porB1B+菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果對青霉素和四環(huán)素均呈現(xiàn)不同程度的耐藥。
　　 結(jié)論：我國東南部流行的淋病奈瑟菌主要攜帶porB1B基因，檢出porB1B型菌株血清型有5型類型

7、，以IB3/6-IB2嵌合、IB3和IB3/6血清型常見，IA6為porB1A型菌株優(yōu)勢血清型。淋病奈瑟菌臨床菌株株攜帶的porB基因類型與青霉素和四環(huán)素耐藥密切相關(guān)，porB1B型120和121位突變常見且與兩種抗生素耐藥密切相關(guān)。所建立的mPCR臨床應(yīng)用證明可用于淋病奈瑟菌porB1A和porB1B基因的分型，檢測陽性率90％以上，分型準(zhǔn)確率97.9%以上。
　　 第二部分：肺炎鏈球菌二元信號系統(tǒng)CiaR/H、Pkn2與β-

8、內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)性研究
　　 背景：肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是人類肺炎主要病原體，也可引起腦膜炎、中耳炎等疾病。近年來，肺炎鏈球菌感染性疾病的發(fā)病率一直居高不下，全球每年死于肺炎鏈球菌感染的人數(shù)約為300～500萬人。眾所周知，β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床上治療肺炎鏈球菌等革蘭陽性菌感染性疾病的一線藥物。業(yè)已肯定，肺炎鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥性不斷增強(qiáng)及耐藥菌株廣泛流行，是該菌所致疾病

9、發(fā)病率不斷升高的根本原因。肺炎鏈球菌對β-內(nèi)酰胺耐藥機(jī)制復(fù)雜，已有研究認(rèn)為PBPs突變介導(dǎo)耐藥，PBPs的本質(zhì)是參與細(xì)菌細(xì)胞壁合成的轉(zhuǎn)肽酶、羧肽酶和內(nèi)肽酶類，肺炎鏈球菌有6種PBP。然而，有文獻(xiàn)報(bào)道，除PBPs突變外，還有些與PBPs無關(guān)的基因也與肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺耐藥相關(guān)，肺炎鏈球菌二元信號傳導(dǎo)系統(tǒng)(TCSS)CiaH/CiaR也與β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥密切相關(guān)，ciaH基因突變菌株可出現(xiàn)高水平的耐藥性。又2004年Echeniqu

10、e等發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌具有一種跨膜真核型絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶Pkn2，其磷酸化位點(diǎn)位于N端胞內(nèi)區(qū)，C端胞外區(qū)含有PBP功能結(jié)構(gòu)域(PBP-domain)，兩者構(gòu)成PBP-Ser/Thr激酶聯(lián)合功能結(jié)構(gòu)域(PASTA-domain)。最近Dias等(2009)報(bào)告，Pkn2介導(dǎo)肺炎鏈球菌產(chǎn)生與PBPs突變無關(guān)的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性，但未研究其作用機(jī)制。
　　 方法：采用PCR擴(kuò)增全長ciaR、ciaH和pkn2基

11、因，并建立其原核表達(dá)系統(tǒng)，SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢測目的重組蛋白rCiaR、rCiaH和rPkn2表達(dá)量。免疫家兔制備rCiaR、rCiaH和rPkn2抗血清及IgG。檢測IgG胞外或胞內(nèi)封閉肺炎鏈球菌菌株CiaH和CiaR后，細(xì)菌對青霉素和頭孢噻肟耐藥性的變化。構(gòu)建用于ciaH和pkn2基因敲除的自殺質(zhì)粒pEVP3ciaH和pEVP3pkn2，通過同源重組及插入失活獲得肺炎鏈球菌ATCC6306株ciaH和p

12、kn2基因敲除突變株ciaH-和pkn2-。采用PCR測序及免疫熒光法對ciaH-和pkn2-突變株進(jìn)行鑒定，“transformation test”測定野生株與ciaH-和pkn2-突變株進(jìn)行感受態(tài)測定，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測ciaH和pkn2基因敲除前后相關(guān)基因mRNA水平變化，用二倍瓊脂稀釋法測定菌株基因敲除前后對青霉素G或頭孢噻肟MICs的變化，采用電泳遷移率檢測(ESMA)確定CiaR-P調(diào)控的pbps等靶基因、β-內(nèi)

13、酰胺類抗生素信號激活CiaH/CiaR和Pkn2/PhpP通路及其介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)差異。
　　 結(jié)果：與報(bào)道序列比較，所克隆的ciaR、ciaH和pkn2基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為99.9％～100％和100％。所構(gòu)建的工程菡E.coliBL21DE3pET42a-ciaR、E.coliBL21DE3pET42a-ciaH和E.coliBL21DE3pET32a-pkn2能有效表達(dá)目的重組蛋白rCiaR、rCiaH和rP

14、kn2，其產(chǎn)量分別為細(xì)菌總蛋白的23％、28％和25％。rCiaR、rCiaH和rPkn2抗血清免疫雙擴(kuò)散效價(jià)分別為1:4、1:4和1:8，IgG免疫雙擴(kuò)散效價(jià)都為1:1。CiaR和/或CiaH被抗血清封閉后，頭孢胺噻敏感菌株可出現(xiàn)耐藥性，但耐藥菌株耐藥性無明顯改變，也不影響各菌株對青霉素的耐藥性。PCR測序及免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，所構(gòu)建的ciaH-和pkn2-突變株染色體DNA中ciaH和pkn2基因被插入失活。感受態(tài)測定結(jié)果野生株轉(zhuǎn)

15、化效率為0.08，而ciaH-和stkP-突變株中轉(zhuǎn)化效率為0。RT-PCR檢測結(jié)果ciaH基因敲除突變株(ciaH-)的ciaR和pkn2mRNAs水平明顯低于野生株(P<0.01)，pkn2基因敲除突變株(pkn2-)的ciaH和ciaRmRNAs水平也明顯低于野生株(P<0.01)；ciaH-突變株pbpsmRNAs水平明顯低于野生株(圖3-4A)，pkn2-突變株popsmRNAs水平也明顯低于野生株；0.001～0.004μg

16、/mL青霉素或0.5～2.0μg/mL頭孢噻肟37℃作用肺炎鏈球菌ATCC6306株30min后，ciaH和pkn2和幾乎所有的pbps的mRNAs水平均較抗生素作用前明顯下降(P<0.05)。ciaH-和stkP-突變株對青霉素及頭孢噻肟MIC值分別為40μg/mL、50μg/mL和25μg/mL、30μg/mL明顯高于野生株的0.06和1μg/mL。感受肽鑒定結(jié)果ciaH-和stkP-突變株轉(zhuǎn)化效率為0。ESMA結(jié)果顯示純化的Cia