大蒜油拮抗酒精性肝損傷及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的
　　 本研究采用一次經(jīng)口給予雄性昆明小鼠4.8 g/kg bw乙醇建立急性酒精性肝損傷模型,通過(guò)測(cè)定血清和肝臟生化指標(biāo)以及肝臟病理改變,評(píng)價(jià)大蒜油拮抗急性酒精性肝損傷的效果；并從機(jī)體抗氧化系統(tǒng)、線粒體功能、肝臟乙醇代謝酶系以及脂肪代謝等方面探討大蒜油拮抗急性酒精性肝損傷的機(jī)理。最后,采用人正常肝細(xì)胞建立體外損傷模型,觀察大蒜油對(duì)乙醇損傷LO2細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 研究方法
　　 1.健康雄性昆明小鼠隨

2、機(jī)分為3個(gè)大組,分別給予30 d、7 d和1次大蒜油或等體積玉米油處理后,一次性經(jīng)口給予4.8 g/kg bw乙醇誘導(dǎo)急性酒精性肝損傷,測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、肝體比值和肝臟甘油三酯含量以及病理學(xué)改變,評(píng)價(jià)大蒜油拮抗急性酒精性肝損傷的效果。
　　 2.稱取適量肝組織,制備10％肝組織勻漿,利用試劑盒測(cè)定肝勻漿中丙二醛和還原性谷胱甘肽的含量,以及超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽S

3、-轉(zhuǎn)移酶的活性,反映機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的改變。
　　 3.差速離心法制備線粒體,測(cè)定線粒體膜電位和腫脹度來(lái)反映線粒體的功能；測(cè)定線粒體懸液中MDA和GSH含量,以及Mn-SOD和GPx的活性,來(lái)反映線粒體抗氧化體系功能。
　　 4.制備10％肝組織勻漿,測(cè)定乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性,評(píng)價(jià)大蒜油對(duì)ADH和ALDH活性的影響。
　　 5.超速離心法制備微粒體,測(cè)定細(xì)胞色素P4502E1、1A2、3A的活性和蛋白表達(dá)；

4、RT-PCR法測(cè)定CYP2E1的mRNA水平。
　　 6.測(cè)定胞漿中乳酸/丙酮酸的比值,反映NAD+/NADH的比值；ELISA法測(cè)定血清中極低密度脂蛋白水平,反映脂肪外輸；測(cè)定血清游離脂肪酸含量,反映外周脂肪動(dòng)員；測(cè)定肝臟中磷酸化的.AMP依賴的蛋白激酶、磷酸化的乙酰輔酶A羧化酶、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1以及脂肪酸合成酶的蛋白水平和肝臟中FFA以及血清中脂聯(lián)素和腫瘤壞死因子-α的含量的動(dòng)態(tài)變化,

5、探討大蒜油拮抗急性酒精性脂肪肝的分子機(jī)制。
　　 7.培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞,建立酒精損傷細(xì)胞模型,測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST的活性,細(xì)胞中MDA、GSH和TG含量,以及細(xì)胞中CYP2El和Caspase-3的蛋白表達(dá),評(píng)價(jià)大蒜油拮抗乙醇所致的LO2細(xì)胞損傷的效果。
　　 研究結(jié)果
　　 1.大蒜油拮抗急性酒精性肝損傷的效果評(píng)價(jià)
　　 1.1提前給予30 d大蒜油有效的拮抗了急性酒精性肝損傷
　　

6、肝臟冰凍切片蘇丹Ⅲ染色結(jié)果顯示,對(duì)照組未見(jiàn)脂滴,模型組有大量的橙黃色脂滴蓄積,三個(gè)劑量大蒜油組脂滴明顯減少變小。
　　 1.2提前給予7 d大蒜油有效的拮抗了急性酒精性肝損傷
　　 病理學(xué)檢查可見(jiàn),大蒜油各組肝臟切片橙黃色脂滴明顯減少變小。
　　 1.3提前2 h給予1次大蒜油有效的拮抗了急性酒精性肝損傷
　　 病理學(xué)檢查顯示,大蒜油組肝臟切片橙黃色脂滴明顯減少變小。
　　 1.4不同時(shí)間給予大蒜

7、油拮抗急性酒精性肝損傷的效果比較
　　 病理學(xué)檢查顯示,大蒜油提前給予組和與乙醇同時(shí)給予組小鼠肝臟脂肪變性明顯減輕:大蒜油延后給予組脂滴較模型組略有減少。
　　 2.大蒜油對(duì)小鼠肝臟抗氧化系統(tǒng)的影響
　　 2.1提前給予30 d大蒜油提高了機(jī)體的抗氧化能力
　　 與模型組相比,高劑量大蒜油組小鼠肝勻漿SOD、GR、CAT的活性分別升高了27.51％、33.57％和18.58％。
　　 2.2提前給

8、予7 d大蒜油提高了機(jī)體的抗氧化能力
　　 2.3提前2 h給予1次大蒜油提高了機(jī)體的抗氧化能力
　　 2.4提前2h給予1次大蒜油對(duì)線粒體功能和線粒體抗氧化系統(tǒng)的影響
　　 與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝細(xì)胞線粒體A540nm降幅在8、16 h時(shí)間點(diǎn)分別增加了45.70％和42.47％(P<0.01)；提前給予大蒜油各組小鼠5 min內(nèi)A540nm降幅較模型組均顯著降低。
　　 3.大蒜油對(duì)小鼠肝臟乙醇代謝

9、酶系的影響
　　 3.1大蒜油對(duì)小鼠肝臟ADH和ALDH活性的影響
　　 大蒜油對(duì)小鼠肝細(xì)胞胞漿中ADH和ALDH的活性無(wú)顯著影響。
　　 3.2大蒜油對(duì)小鼠肝臟CYP2EI活性、蛋白和mRNA水平的影響
　　 3.3大蒜油對(duì)小鼠肝臟CYP1A2活性和蛋白水平的影響
　　 3.4大蒜油對(duì)小鼠肝臟CYP3A活性和蛋白水平的影響
　　 大蒜油和乙醇對(duì)小鼠肝臟CYP3A的活性無(wú)顯著影響。

10、　　 4.大蒜油對(duì)小鼠急性酒精性脂肪肝各因素的影響
　　 4.1大蒜油對(duì)血清中VLDL含量的影響
　　 大蒜油和乙醇對(duì)小鼠血清中VLDL含量均無(wú)顯著影響。
　　 4.2大蒜油對(duì)乙醇所致的NAD+/NADH的比值的影響
　　 4.3大蒜油對(duì)血清和肝臟中FFA水平的影響
　　 與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清FFA水平在16 h時(shí)間點(diǎn)增加了17.91％(P<0.01)。與模型組相比,低中高劑量大蒜油組小

11、鼠血清FFA水平分別下降了19.69％、31.76％和29.08％(P<0.01)。
　　 4.5大蒜油對(duì)小鼠肝臟mature SREBP-1、PPAR-α、p-AMPK、p-ACC、FAS蛋白水平的影響
　　 與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝臟mSREBP-1蛋白水平在8、16 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別增加了24.39％和10.91％(P<0.05或P<0.01)。與模型組相比,低中高劑量大蒜油組小鼠肝臟mSREBP-1蛋白水平在8

12、 h時(shí)間點(diǎn)分別降低了34.28％、45.41％和53.53％(P<0.01),在16 h時(shí)間點(diǎn)分別降低16.99％、29.52％和47.76％(P<0.01)。
　　 與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝臟PPAR-α的蛋白水平在4、8 h時(shí)間點(diǎn)分別降低了27.13％和51.14％(P<0.01)。與模型組相比,低中高劑量大蒜油組小鼠肝臟PPAR-α蛋白水平在4 h時(shí)間點(diǎn)分別增加了78.83％、105.45％和120.04％(P<0.01

13、),在16 h時(shí)間點(diǎn)分別增加了69.52％、62.66％和70.22％(P<0.01)。
　　 與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝臟P.AMPK蛋白水平在8 h時(shí)間點(diǎn)增加46.70％(P<0.01)。與模型組相比,低中高劑量大蒜油組小鼠肝臟P-AMPK的蛋白水平在4 h時(shí)間點(diǎn)分別增加了26.97％、56.31％和86.89％(P<0.05或<0.01)。在8 h時(shí)間點(diǎn),低中高劑量大蒜油組小鼠肝臟p-AMPK的蛋白水平亦高于對(duì)照組,但低于

14、模型組。在16 h時(shí)間點(diǎn),各組小鼠肝臟p-AMPK的蛋白水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝臟P-ACC蛋白水平在4 h時(shí)間點(diǎn)下降了17.65％(P<0.01),在8 h時(shí)間點(diǎn)增加了80.91％(P<0.01)。與模型組相比,低中高劑量大蒜油組小鼠肝臟P-ACC的蛋白水平在4 h時(shí)間點(diǎn)分別增加了32.48％、19.64％和47.89％(P<0.05或P<0.01)。在8 h時(shí)間點(diǎn),大蒜油組小鼠肝臟P

15、-ACC蛋白水平較對(duì)照組亦顯著增加(P<0.05),但低于模型組水平。在16 h時(shí)間點(diǎn),各組別小鼠肝臟中p-ACC蛋白的水平無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝臟FAS的蛋白水平在8 h時(shí)間點(diǎn)增加了12.93％(P<0.05)；低中高劑量大蒜油組小鼠肝臟FAS的蛋白水平在4 h時(shí)間點(diǎn)分別降低了40.00％、53.45％和70.06％(P<0.01),在8 h時(shí)間點(diǎn)分別降低了36.87％、47.5

16、5％和66.83％(P<0.01),在16 h時(shí)間點(diǎn)分別降低10.62％、35.59％和52.12％(P<0.01)。
　　 5.大蒜油對(duì)乙醇損傷LO2細(xì)胞的影響
　　 5.1大蒜油對(duì)LO2細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶活性和TG含量的影響
　　 大蒜油顯著抑制了100 mM的乙醇所致LO2細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶活性和TG含量的升高。
　　 5.2大蒜油對(duì)LO2細(xì)胞中MDA和GSH含量的影響
　　 5.3大蒜油對(duì)

17、LO2細(xì)胞中脂肪含量的影響
　　 油紅O染色結(jié)果顯示,乙醇組LO2細(xì)胞中可見(jiàn)較多的紅色的脂肪著色；對(duì)照組和大蒜油組未見(jiàn)明顯的脂肪著色:大蒜油和乙醇共處理組脂肪變性程度較乙醇組明顯減輕。
　　 5.4大蒜油對(duì)LO2細(xì)胞中CYP2E1和Caspase-3蛋白含量的影響
　　 結(jié)論
　　 1.一定劑量的大蒜油可有效拮抗4.8 g/kg bw乙醇所致小鼠急性肝損傷和100mM乙醇所致的LO2細(xì)胞損傷。
　　

18、 2.大蒜油可通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力抵抗急性酒精所致的氧化應(yīng)激,維持線粒體的正常功能；抗氧化活性是大蒜油發(fā)揮拮抗急性酒精性肝損傷的機(jī)制之一。
　　 3.大蒜油拮抗急性酒精性肝損傷的作用可能與其顯著抑制CYP2E1的活性和蛋白水平有關(guān)。
　　 4.大蒜油拮抗急性酒精所致的肝臟脂肪蓄積,可能與其增強(qiáng)了脂肪酸的氧化代謝和減少脂肪酸的合成有關(guān)。
　　 5.一定劑量的大蒜油對(duì)CYP2E1和1A2的抑制作用會(huì)隨著給予時(shí)間的