非酒精性脂肪肝與肝癌的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）與肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的關(guān)系，并探討核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)以及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)在致病機(jī)制中的作用。
　　方法：1、分組:將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組:空白對(duì)照組取15只小鼠、常規(guī)飲食組及高脂飲食組各取

2、45只小鼠。各組小鼠置于動(dòng)物房適應(yīng)一周后對(duì)空白對(duì)照組及常規(guī)飲食組小鼠采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組小鼠則給予高脂飼料喂養(yǎng)。
　　2、動(dòng)物模型的建立及樣本的采集:高脂飲食組小鼠自由飲用自來水，予高脂飼料喂養(yǎng)15周建立NAFLD模型，飼料脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物供能比例分別為42％、20％、38％;常規(guī)飲食組及空白對(duì)照組小鼠自由飲用自來水，予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，飼料脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物供能比例分別為19％、21％、60％。16周起高脂飲食

3、組及常規(guī)飲食組小鼠予DEN45mg/kg每周一次腹腔注射，空白對(duì)照組不予任何藥物干預(yù)，于建模15周、20周、25周、30周隨機(jī)選取常規(guī)飲食及高脂飲食組每組各5只小鼠，空白對(duì)照組隨機(jī)抽取3只小鼠，收集小鼠血清，完整剖取小鼠肝臟，將肝組織置于10％中性福爾馬林溶液中固定，常規(guī)切片HE染色光鏡下觀察肝組織病理改變，36周處死所有小鼠，同上采集各時(shí)期各組小鼠血清及肝組織。
　　3、一般情況的觀察:每天觀察小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、反應(yīng)、進(jìn)食飲水

4、情況、毛發(fā)光澤度、大小便、體型變化等情況，每周稱取一次小鼠體重。
　　4、各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè):①酶偶聯(lián)比色法檢測(cè)血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的含量。②酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(enzyme-linkedimmunosorben

5、t assay，Elisa)法檢測(cè)血清NF-κB、IL-6水平。
　　5、小鼠肝組織病理學(xué)觀察:將各時(shí)期各組小鼠固定的肝臟進(jìn)行常規(guī)包埋、切片，HE染色光鏡下觀察肝臟組織動(dòng)態(tài)病理學(xué)改變。
　　6、小鼠肝臟腫瘤行為的觀察:觀察36周剩余小鼠肝臟的形態(tài)、大小、顏色、質(zhì)地，是否有結(jié)節(jié)樣增生及增生結(jié)節(jié)數(shù)目，結(jié)合病理切片HE染色結(jié)果判斷是否為肝癌，計(jì)算各組小鼠建模過程中的死亡率及誘癌成功率（死亡率=每組小鼠的死亡個(gè)數(shù)/各組小鼠總數(shù)×10

6、0％，誘癌成功率=各組小鼠誘癌成功的個(gè)數(shù)/各組小鼠總數(shù)×100％）。
　　研究結(jié)果：1、一般情況:空白對(duì)照組小鼠:進(jìn)食飲水正常，毛發(fā)密而有光澤，體重增長(zhǎng)較快，至16周小鼠體重增長(zhǎng)趨于平穩(wěn);高脂飲食組小鼠及常規(guī)飲食組小鼠16周前體重增長(zhǎng)呈明顯上升的趨勢(shì)，體重增長(zhǎng)穩(wěn)定，一般情況較好，高脂飲食組小鼠體型肥胖，且各時(shí)期體重均明顯高于常規(guī)飲食組，16周起受致癌劑毒性的影響，小鼠體重增長(zhǎng)緩慢且出現(xiàn)下降趨勢(shì)，小鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，攝食減少，活

7、動(dòng)減少，體型變瘦削，毛發(fā)稀疏無光澤，一般情況差，20周起高脂飲食及常規(guī)飲食組小鼠體重均低于空白對(duì)照組，且進(jìn)行性下降，但高脂飲食組小鼠的體重始終高于常規(guī)飲食組。
　　2、小鼠NAFLD模型的建立:三組小鼠喂養(yǎng)15周后，高脂飲食組小鼠體型較其他兩組明顯肥胖，小鼠肝臟體積較其它組略大，包膜緊光滑，邊緣變鈍，切面外翻，質(zhì)地柔軟，有油膩感，光鏡下HE常規(guī)病理切片可見肝細(xì)胞內(nèi)聚集了大量的細(xì)小脂滴，細(xì)胞胞質(zhì)被脂滴占據(jù)呈漁網(wǎng)狀，發(fā)生脂肪變性的肝細(xì)

8、胞呈全小葉分布，可見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。空白對(duì)照組及常規(guī)飲食組小鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)未見有明顯的脂滴，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，排列成單板狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間未見有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　3、血清肝酶、血脂的測(cè)定:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)15周后高脂飲食組小鼠血清TG、TC水平較空白對(duì)照組有明顯升高（P＜0.01），且肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷，ALT、AST含量升高(P＜0.01)，16周起予致癌劑DEN干預(yù)后，小鼠食欲減退，一般情況變差，體重減輕，小鼠血清TG、T

9、C水平下降，常規(guī)飲食及高脂飲食組小鼠受致癌劑毒性的影響，20周起小鼠血清ALT、AST出現(xiàn)急劇升高(P＜0.01)，高脂飲食組小鼠各時(shí)期血清ALT、AST水平均高于常規(guī)飲食組(P＜0.01)，由于肝細(xì)胞進(jìn)行性損傷及壞死，36周小鼠血清ALT、AST較30周有所下降。
　　4、小鼠血清NF-κB、IL-6的變化:喂養(yǎng)15周后高脂飲食組小鼠血清NF-κB、IL-6水平升高，且明顯高于常規(guī)飲食組及空白對(duì)照組小鼠(P＜0.01)，化學(xué)劑D

10、EN干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組小鼠NF-κB、IL-6水平急劇升高，且隨著藥物時(shí)間干預(yù)的延長(zhǎng)，小鼠體內(nèi)炎癥因子NF-κB、IL-6的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，各時(shí)期高脂飲食組小鼠血清NF-κB、IL-6的水平始終高于常規(guī)飲食組小鼠（P＜0.01）。
　　5、肝組織致癌過程的動(dòng)態(tài)病理學(xué)演變:空白對(duì)照組小鼠肝組織在整個(gè)造模過程中未出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變，小鼠肝臟紅潤(rùn)、光滑，質(zhì)軟，表面未見結(jié)節(jié)樣增生物及出血壞死灶。光鏡下可見肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞未見明顯炎癥、損

11、傷、壞死及異形增生樣改變。36周成功誘導(dǎo)出肝癌，常規(guī)飲食及高脂飲食組小鼠在肝癌形成的過程中大致經(jīng)歷以下三期:肝臟炎性損傷期→肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、肝組織纖維化及肝硬化期→肝癌形成期。
　　6、各組小鼠誘癌成功率的比較:空白對(duì)照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中未觀察到有自發(fā)成癌及死亡的現(xiàn)象;常規(guī)飲食組小鼠在實(shí)驗(yàn)23周、25周、31周、33周各有1、1、2、1只小鼠發(fā)生死亡，死亡率為11.1％(5/45)，36周剩余20只小鼠中8只成功誘導(dǎo)為肝癌，誘

12、癌成功率為40％(8/20);高脂飲食組小鼠于實(shí)驗(yàn)21周、23周、28周、29周、33周各有2、1、1、1、2只小鼠發(fā)生死亡，死亡率為15.6％(7/45)，36周剩余18只小鼠15只成功誘導(dǎo)為肝癌，誘癌成功率為83.3％(13/18)。
　　結(jié)論:1、高脂飼料喂養(yǎng)小鼠15周后成功建立出NAFLD動(dòng)物模型，16周起對(duì)小鼠行DEN干預(yù)后36周成功誘導(dǎo)出HCC。
　　2、高脂飲食組小鼠利用化學(xué)劑DEN誘導(dǎo)HCC的成功率明顯高于常