酒精性肝損傷中胰島素信號(hào)的關(guān)鍵作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　酒精性肝損傷嚴(yán)重威脅酗酒人群的健康，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)亟待解決的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。一般認(rèn)為氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體功能障礙、凋亡與乙醛毒性均與酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量的酒精攝入能夠?qū)е乱葝u素信號(hào)受損，但是關(guān)于胰島素信號(hào)對(duì)酒精性肝損傷影響的相關(guān)研究還非常匱乏。以往的文獻(xiàn)表明，作為一種調(diào)節(jié)糖穩(wěn)態(tài)的重要內(nèi)分泌激素，胰島素具有維持線粒體功能、抗凋亡、抗炎、抗氧化等作用。我們實(shí)驗(yàn)室最近的研究也證實(shí)胰島素信號(hào)可以

2、通過(guò)調(diào)控Nrf-2為核心的抗氧化酶調(diào)節(jié)氧化還原平衡。肝也是胰島素作用的敏感靶器官之一。以上現(xiàn)象提示，胰島素信號(hào)激活可能是機(jī)體拮抗酒精性肝損傷的重要內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。胰島素信號(hào)功能障礙的最典型表現(xiàn)是胰島素抵抗，研究表明胰島素抵抗能夠?qū)е掳ǜ闻K在內(nèi)的諸多組織或器官發(fā)生氧化還原調(diào)控異常。我們推測(cè)，胰島素抵抗可能對(duì)酒精性肝損傷的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用。根據(jù)以上的研究進(jìn)展和教研室的前期工作，我們提出的科學(xué)問(wèn)題是：胰島素信號(hào)激活對(duì)酒精性肝損

3、傷的影響及分子機(jī)制是什么？胰島素抵抗對(duì)酒精性肝損傷的影響及分子機(jī)制又是什么？回答上述問(wèn)題無(wú)疑有助于闡明酒精性肝損傷中胰島素信號(hào)的關(guān)鍵作用，同時(shí)為酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)及其防治提供新的思路。在此基礎(chǔ)上還能初步揭示不同胰島素水平和敏感性人群飲酒危害存在差異性的原因，進(jìn)而為特定人群（如1型糖尿病病人和2型糖尿病病人）進(jìn)行針對(duì)性的酒精性肝損傷健康教育和防治提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1．研究胰島素信號(hào)激活對(duì)酒精性肝損傷

4、的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　2．研究胰島素抵抗對(duì)酒精性肝損傷的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　3．探討氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、凋亡、炎癥、脂代謝紊亂等相關(guān)病理因素在胰島素信號(hào)對(duì)酒精性肝損傷影響中的改變。
　　4．探討以Nrf-2為核心的抗氧化防御系統(tǒng)功能、以CYP2E1為代表的酒精代謝酶、iNOS介導(dǎo)的NO生成、血清脂聯(lián)素水平在胰島素信號(hào)對(duì)酒精性肝損傷影響中的作用。
　　方法：
　　1．胰島素信號(hào)激活對(duì)酒精性肝損傷影響

5、的體外實(shí)驗(yàn)：L02細(xì)胞先給予50nM胰島素預(yù)處理4小時(shí)，間隔4小時(shí)后給予大劑量酒精刺激誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷。MTT檢測(cè)細(xì)胞活力、試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液上清AST/LDH活力、光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷。Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡、Western Blotting檢測(cè)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)、試劑盒檢測(cè)Caspase-3活力評(píng)價(jià)凋亡。采用Rhodamine123檢測(cè)MMP、MitoSOX檢測(cè)線粒體ROS、試劑盒檢測(cè)

6、mPTP開放和ATP含量、Clark耗氧儀檢測(cè)線粒體耗氧速率評(píng)價(jià)線粒體功能。采用DCFH-DA和DHE探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平、試劑盒檢測(cè)MDA和GSSG評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激。試劑盒檢測(cè)GSH含量、GSH/GSSG比值、SOD和GR活性、Western Blotting檢測(cè)Nrf-2蛋白表達(dá)評(píng)價(jià)抗氧化防御系統(tǒng)。試劑盒檢測(cè)CYP2E1活性，Western Blotting檢測(cè)ADH、ALDH、CYP2E1蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)CYP2E1的m

7、RNA表達(dá)評(píng)價(jià)酒精代謝酶改變。最后通過(guò)檢測(cè)Akt和Erk的磷酸化水平和PI3K和Erk的抑制劑研究PI3K/Akt和Erk通路在其中的作用。
　　2．胰島素信號(hào)激活對(duì)酒精性肝損傷影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：小鼠給予胰島素腹腔注射激活胰島素信號(hào)，4小時(shí)后給予大劑量酒精灌胃,每日兩次，持續(xù)7天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)動(dòng)物體重、肝重和血糖變化。H-E染色檢測(cè)肝病理改變，試劑盒檢測(cè)血清ALT/AST活力評(píng)價(jià)肝損傷。ELISA檢測(cè)血清脂聯(lián)素水平評(píng)價(jià)血清脂聯(lián)素改

8、變。試劑盒檢測(cè)肝MPO活力，RT-PCR檢測(cè)炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)。Western Blotting檢測(cè)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)、試劑盒檢測(cè)Caspase-3的活力評(píng)價(jià)凋亡改變。試劑盒檢測(cè)肝勻漿ATP含量，新鮮分離線粒體并采用MTT檢測(cè)線粒體活力和耗氧儀檢測(cè)線粒體耗氧速率評(píng)價(jià)肝細(xì)胞線粒體功能。采用DHE探針檢測(cè)肝冰凍切片ROS的水平，試劑盒檢測(cè)肝勻漿中MDA、GSSG的含量，檢測(cè)線粒體勻漿中GSSG的含

9、量，Western Blotting檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)及NO含量以評(píng)價(jià)肝臟氧化應(yīng)激。檢測(cè)肝勻漿GSH含量、GSH/GSSG比值，PRX-1、CAT、SOD-1、SOD-2、GR、GCLC、GPX-1及Nrf-2的蛋白表達(dá)或活性評(píng)價(jià)肝抗氧化防御系統(tǒng)的改變。RT-PCR檢測(cè)CYP2E1的基因表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)CYP2E1、ADH、ALDH2的蛋白和活性水平評(píng)價(jià)酒精代謝相關(guān)酶的改變。最后通過(guò)檢測(cè)肝甘油三酯水平和SREBP-1c的基因蛋白表達(dá)觀察

10、肝脂肪的改變。
　　3．胰島素信號(hào)功能障礙對(duì)酒精性肝損傷影響的體外實(shí)驗(yàn)：L02細(xì)胞先給予5μM地塞米松預(yù)處理24小時(shí)誘導(dǎo)胰島素抵抗，通過(guò)檢測(cè)胰島素激活的Akt磷酸化和葡萄糖攝取鑒定胰島素抵抗。我們觀察了胰島素抵抗對(duì)酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞活力損傷、凋亡、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激的影響，同時(shí)檢測(cè)了以Nrf-2為核心的抗氧化防御系統(tǒng)及CYP2E1的改變。主要實(shí)驗(yàn)方法與胰島素信號(hào)激活體外實(shí)驗(yàn)（1）相一致。
　　4．胰島素信號(hào)功能障礙對(duì)酒精性

11、肝損傷影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：小鼠首先給予高脂飲食同時(shí)腹腔注射tBHP，持續(xù)30天，之后給予酒精暴露。通過(guò)空腹血糖和胰島素檢測(cè)、IPGTT和IPITT鑒定胰島素抵抗。我們觀察了胰島素抵抗對(duì)酒精誘導(dǎo)肝損傷、凋亡、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和肝脂肪代謝紊亂的影響，同時(shí)檢測(cè)了抗氧化防御系統(tǒng)、酒精代謝相關(guān)酶、iNOS介導(dǎo)的NO生成、血清脂聯(lián)素水平的改變，主要實(shí)驗(yàn)方法與胰島素信號(hào)激活體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（2）相一致。
　　結(jié)果：
　　1．通過(guò)胰島素預(yù)處理激

12、活胰島素信號(hào)能顯著抑制酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞活力損傷、凋亡、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激。胰島素預(yù)處理能提高以Nrf-2為核心的抗氧化防御系統(tǒng)功能，還顯著抑制了酒精誘導(dǎo)的CYP2E1激活。PI3K和Erk的抑制劑能夠在一定程度上抑制胰島素對(duì)酒精性肝細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　2．通過(guò)胰島素預(yù)處理激活胰島素信號(hào)能抑制酒精導(dǎo)致的肝體比增加和空腹血糖降低，還減輕了酒精導(dǎo)致的肝損傷、炎癥、凋亡、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激。胰島素預(yù)處理通過(guò)激活Nrf-2增強(qiáng)

13、了抗氧化防御系統(tǒng)功能，同時(shí)還抑制了酒精誘導(dǎo)的肝組織CYP2E1和iNOS激活、血清脂聯(lián)素水平降低。但胰島素預(yù)處理也促進(jìn)了酒精誘導(dǎo)的肝SREBP-1c激活和甘油三酯水平升高。
　　3．地塞米松處理成功誘導(dǎo)L02細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞ROS的生成。胰島素抵抗促進(jìn)了酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞活力損傷、凋亡、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激，同時(shí)發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗進(jìn)一步降低了以Nrf-2為核心的抗氧化防御系統(tǒng)功能，還進(jìn)一步促進(jìn)了酒精誘導(dǎo)的肝CYP2E

14、1激活。
　　4．高脂飲食加tBHP處理成功誘導(dǎo)小鼠發(fā)生胰島素抵抗。胰島素抵抗促進(jìn)了酒精誘導(dǎo)的體重減輕和肝體比增加，還促進(jìn)了酒精誘導(dǎo)的肝損傷、炎癥、凋亡、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激。胰島素抵抗通過(guò)抑制Nrf-2活化而減弱了抗氧化防御系統(tǒng)功能，同時(shí)還進(jìn)一步促進(jìn)了酒精誘導(dǎo)的肝組織CYP2E1和iNOS激活、血清脂聯(lián)素水平下降。胰島素抵抗進(jìn)一步促進(jìn)了酒精誘導(dǎo)的肝組織SREBP-1c激活和甘油三酯升高。
　　結(jié)論：
　　1．胰島

15、素信號(hào)激活通過(guò)抗氧化、抗炎、抗凋亡、維持線粒體功能等途徑對(duì)酒精誘導(dǎo)肝氧化損傷發(fā)揮保護(hù)作用，但胰島素信號(hào)激活還能促進(jìn)酒精導(dǎo)致的肝脂肪代謝紊亂。該結(jié)果提示，胰島素信號(hào)激活既是機(jī)體拮抗酒精性肝氧化損傷的重要內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，又是酒精脂肪肝發(fā)生的重要促進(jìn)因素，具有“雙刃劍”效應(yīng)。
　　2．胰島素信號(hào)激活減輕酒精性肝氧化損傷的保護(hù)機(jī)制可能與以Nrf-2為核心的抗氧化防御系統(tǒng)功能增強(qiáng)、CYP2E1和iNOS抑制、血清脂聯(lián)素水平升高密切相關(guān)。胰島