PAX4、NeuroD1基因多態(tài)性與自身抗體陰性酮癥傾向糖尿病的關聯研究.pdf

1、酮癥傾向糖尿病(ketosis-prone diabetes,KPD)是一種以無誘因的酮癥或酮癥酸中毒起病而臨床表現異質性很大的綜合癥，它包括自身免疫性1型糖尿?。?A型）和胰島自身抗體陰性的特發(fā)1型糖尿病（1B型）。目前對于胰島自身抗體陰性的KPD的病因知之甚少，由于該類患者體內缺乏自身免疫破壞β細胞的證據，因此，遺傳和環(huán)境因素可能是其主要病因，在遺傳性因素中影響β細胞分化成熟和胰島素分泌的轉錄因子如PAX4、NeuroD1、PDX1

2、等近年來受到研究者的關注。但在已有的相關研究中缺乏中國人群的研究，有關多態(tài)性的關聯分析手段也相對簡單。因此本研究選擇與β細胞分化成熟和胰島素分泌有關的轉錄因子PAX4和NeuroD1基因作為候選基因，設計一個兩步的病例-對照關聯分析，即首先在小樣本人群中應用變性高效液相色譜技術(DHPLC)進行PAX4基因突變篩查，從檢測出的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)中選擇等位基因頻率＞1％的

3、4個SNP，加上我們在另一研究中已對NeuroD1基因篩查出的一個SNP，在所有樣本中對兩基因的5個SNP進行基因分型及關聯分析。通過采用單點分析，單倍型分析與多點聯合作用分析相結合的關聯分析方法，探討這些基因的多態(tài)性對中國漢族自身抗體陰性KPD易感性的影響。
　　 第一部分、胰島自身抗體陰性酮癥傾向糖尿病的PAX4基因突變篩查
　　 目的：建立變性高效液相色譜技術(DHPLC)的檢測方法，篩查中國漢族胰島自身抗體陰性的

4、酮癥傾向糖尿病(KPD)的PAX4基因突變
　　 設計：病例-對照研究
　　 方法：采用變性高效液相色譜技術(DHPLC)結合直接測序法，檢測141例胰島自身抗體GAD-Ab和IA-2A陰性的酮癥起病糖尿病患者和112例非糖尿病正常對照者的PAX4基因的九個外顯子區(qū)的突變情況。
　　 結果：
　　 1.成功建立了DHPLC檢測PAX4基因的方法。
　　 2.DHPLC檢測到PAX4基因的外顯子1、

5、4、5、9分別有2、137、41和86例出現異常峰型，經測序證實均有堿基改變，檢出符合率100％。
　　 3.共檢測到PAX4基因9個外顯子區(qū)的7種堿基改變，它們分別是：外顯子1的錯義突變Arg31Gln(G298A)，外顯子4的同義突變Gln173Gln(A725G,rs327517)和錯義突變Lys147Arg(A649G)，外顯子5的錯義突變Arg183Cys(C753T)、Arg192Ser(C780A,rs382400

6、4)和Arg192His(G781A,rs2233580)，外顯子9的錯義突變His321Pro(A1168C,rs712701)。其中外顯子4的錯義突變Lys147Arg(A649G)為新發(fā)現的突變位點。
　　 結論：
　　 在中國漢族人群中，PAX4基因有6種常見多態(tài)性改變，分別為Arg31Gln、Gln173Gln、Arg183Cys、Arg192Ser、Arg192His、His321Pro。
　　 第二

7、部分、自身抗體陰性KPD的PAX4基因多態(tài)性關聯研究
　　 目的：探討PAX4基因多態(tài)性與中國漢族胰島自身抗體陰性酮癥傾向糖尿病(KPD)的關系。
　　 設計：病例-對照研究
　　 方法：采用多聚酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術檢測296例胰島自身抗體GAD-Ab和IA-2A陰性的KPD患者、399例正常對照者的PAX4基因外顯子9的多態(tài)性His321Pro的基因型。采用PCR-直接測序法檢測

8、PAX4基因外顯子5的多態(tài)性Arg183Cys、Arg192Ser、Arg192His的基因型。分析PAX4基因各多態(tài)性與KPD的關系，同時分析各多態(tài)性位點所構成的單體型與KPD的關系。
　　 結果：
　　 1.自身抗體陰性的KPD患者PAX4Arg183Cys的CT基因型和T等位基因頻率與正常對照者比較，差異均無顯著性。CT基因型患者與CC基因型患者的BMI(P＝0.025)和FCP水平(P＝0.024)比較差異均有顯

9、著性。
　　 2.自身抗體陰性的KPD患者與正常對照組比較，Arg192Ser的AA基因型(0.7％vs0％,x2＝8.183,P＝0.015)和A等位基因頻率(6.6％VS3.4％,OR＝2.014,95％CI＝1.218～3.329,P＝0.005)明顯增高。其中，男性(6.7％vs3.5％,P＝0.03)和起病年齡＜20歲(9.6％vs3.4％,P＝0.003)的KPD患者A等位基因頻率高于正常對照。
　　 3.自

10、身抗體陰性的KPD患者PAX4基因Arg192His的AA基因型(16.9％vs10.0％,P＝0.04)和A等位基因頻率(10.6％VS6.8％,OR＝1.641,95％CI＝1.122～2.400,P＝0.01)高于正常對照者。女性(10.8％vs5.6％,P＝0.04)和起病年齡≥20歲(11.1％vs6.8％,P＝0.007)的KPD患者的A等位基因頻率高于正常對照。
　　 4.自身抗體陰性的KPD患者PAX4基因His

11、321Pro各基因型頻率和等位基因頻率與對照組比較，差異均無顯著性(P＞0.05)。男性KPD患者的CC基因型(15％vs12.1％,x2＝6.74,P＝0.03)和C等位基因頻率(40.3％vs31.9％,x2＝4.25,P＝0.04)均高于女性KPD患者。
　　 5、自身抗體陰性的KPD患者PAX4基因單體型AACC的頻率(8.8％vs5.2％,X2＝7.199,OR＝1.778,95％CI＝1.164～2.717,P＝0.

12、007)和單體型CGAC的頻率(4.0％vs2.0％,x2＝4.611,OR＝2.065,95％CI＝1.087～3.923,P＝0.032)均高于正常對照。而單體型CGCC在正常對照組中的頻率高于起病年齡≥35歲KPD患者(35.7％vs28.7％,x2＝4.64,OR＝0.725,95％CI＝0.54～0.975,P＝0.031)。
　　 結論：
　　 1.PAX4基因Arg192Ser和Arg192His多態(tài)性與中

13、國漢族胰島自身抗體陰性的KPD有關聯。
　　 2.PAX4基因單體型AACC和單體型CGAC是中國漢族胰島自身抗體陰性的KPD的易感單體型，單體型CGCC是起病年齡≥35歲KPD患者的保護性單體型。
　　 第三部分、NeuroD1基因A45T多態(tài)性與自身抗體陰性KPD的關系
　　 目的：探討NeuroD1基因A45T多態(tài)性與中國漢族胰島自身抗體陰性酮癥傾向糖尿病(KPD)的關系。設計：病例-對照研究。
　　

14、 方法：采用PCR-測序法檢測NeuroD1基因A45T基因型，分析NeuroD1基因A45T多態(tài)性與KPD的關系，同時分析NeuroD1基因A45T多態(tài)性與PAX4基因各多態(tài)性位點的交互作用對KPD的影響。
　　 結果：
　　 1.自身抗體陰性的KPD患者NeuroD1基因A45T的AA基因型頻率和A等位基因頻率與NC組比較差異均無顯著性(P＝0.34)。對患者進行年齡和性別分層后仍沒有發(fā)現NeuroD1基因A45T

15、基因型頻率與對照組有差別。
　　 2.選擇PAX4基因的3個多態(tài)位點C780A、G781A、C1168A與NeuroD1基因的Ala45Thr多態(tài)性位點進行對KPD的交互作用分析。結果顯示，Ala45Thr多態(tài)性與PAX4的各多態(tài)性位點對KPD沒有交互作用。
　　 結論：
　　 1.NeuroD1基因的Ala45Thr多態(tài)性與中國漢族自身抗體陰性的KPD沒有相關性。
　　 2.NeuroD1基因的Ala4