Periostin在胰腺癌體外研究及其血清濃度的臨床研究.pdf

1、背景與目的：胰腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。美國2001年有胰腺癌新發(fā)病例29200例，約有28900人因胰腺癌而死亡。數(shù)十年來，盡管研究者致力于胰腺癌的研究，但收效甚微。胰腺癌在消化系腫瘤中預(yù)后最差，5年生存率不到5％。根治性切除是唯一可能治愈的方法，但手術(shù)切除率僅為9％；同時胰腺癌易局部復(fù)發(fā)，肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，也是預(yù)后極差的重要因素。通過胰腺癌發(fā)病機制的廣泛、深入研究，尋求早期診斷、預(yù)后判斷的特異性標(biāo)記物是有效防治胰腺癌，改善預(yù)

2、后的關(guān)鍵。Periostin(PN)最初在鼠成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)而命名為成骨細(xì)胞特異因子-2(osteoblast-specific factor-2，Osf-2)，具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞黏附和分化的功能。近年的動物實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)，PN有促進惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、抑制凋亡，促進荷瘤裸鼠的腫瘤生長，促進腫瘤新生血管形成等作用。臨床研究表明：在多種惡性腫瘤中，血清PN濃度均升高，且升高程度與惡性腫瘤臨床病理特征有一定關(guān)系，可見，PN有望成為評估惡

3、性腫瘤臨床病情和判斷患者預(yù)后的新指標(biāo)，但目前，國內(nèi)外尚未有PN血清濃度檢測商品化的試劑盒。為進一步研究PN在胰腺癌中作用機制，本研究：(1)克隆PN基因，將其裝載于腺病毒載體內(nèi)，觀察重組腺病毒載體介導(dǎo)PN的基因?qū)雽θ艘认侔┘?xì)胞株增殖、侵襲影響：(2)建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中骨膜素水平及初步應(yīng)用于臨床 方法：(1)將人PNcDNA基因，插入pDC316中構(gòu)建成腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316-PN，與骨架質(zhì)

4、粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝成重組病毒顆粒，并采用RT-PCR、Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞PN的表達。(2)分別在人胰腺癌細(xì)胞和組織檢測mRNA、蛋白表達；用pAd5/F35-PN感染胰腺癌細(xì)胞BxPC-3。利用MTT法、Transwell小室分別測定實驗組細(xì)胞、空載體對照組細(xì)胞及陰性對照組細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲運動能力的改變。(3)基于ELISA技術(shù)，制備PN血清檢測試劑盒，并進行自制試劑盒的指標(biāo)評價。收集胰

5、腺癌血清標(biāo)本181例，ELISA法檢測血清PN濃度并結(jié)合患者臨床病理及生存期，評價PN在胰腺癌中的臨床應(yīng)用。 結(jié)果：(1)經(jīng)GFP表達證實成功地構(gòu)建了攜帶PN基因的重組腺病毒載體并制備出重組病毒pAd5/F35-PN。(2)Ad5/F35-PN轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞BxPC-3， RT-PCR、Western Blot結(jié)果證實PN在mRNA及蛋白水平上都有表達。pAd5/F35-PN轉(zhuǎn)染BxPC-3后，細(xì)胞增殖能力無顯著變化(p>0.0

6、5)。細(xì)胞計數(shù)示轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞穿透基底膜的數(shù)量及克隆形成數(shù)量較轉(zhuǎn)染前明顯增多(p<0.01)。(3)胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3，SW1990，Panc-1，AsPC-1均無FNmRNA及蛋白表達；胰腺癌組織PN蛋白表達，而癌旁正常組織PN蛋白表達顯著減少；免疫組化提示PN主要表達于癌間質(zhì)。(4)雙抗體夾心ELISA法試劑盒檢測PN的最小檢出限為4.803 ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線在(4.803-500)ng/ml范圍內(nèi)線性良好。平均批內(nèi)變異

7、系數(shù)為7.2％，平均批間變異系數(shù)為14.1％，回收率為84.5％。(5)181例胰腺癌患者的血清PN濃度為38.8±21.8 ng/mL，顯著高于63名健康對照者(21.0±7.3 ng/mL，p<0.01)和47例胰腺良性疾病(23.9±13.2 ng/mL，p<0.01)；有遠處轉(zhuǎn)移者血清PN濃度顯著高于未有遠處轉(zhuǎn)移者(44.4±26.7 ng/ml vs33.1±16.0 ng/ml，p=0.007)：Kaplan-Meier分析

8、提示胰腺癌患者中血清PN濃度升高者(≥35.6 ng/mL)的中位生存期(6.0月，95％CI3.4-8.6)顯著短于PN正常者(10.9月，95％CI10.1-11.7，p<0.001)，Cox風(fēng)險回歸分析提示PN濃度是預(yù)后獨立預(yù)測因素(HR=0.404，95％CI0.241-0.678，p=0.001)。 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了重組腺病毒pAd5/F35-PN，病毒滴度高，在體外可高效轉(zhuǎn)染BxPC-3并有效表達目的基因；(2