NLPR3炎癥小體在糖化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷中的作用研究.pdf

1、目的:葡萄糖的衍生物糖化終末產(chǎn)物(AGEs)可促進(jìn)代謝性炎癥的發(fā)生發(fā)展，但機(jī)制不清。本研究探討NLRP3炎癥小體在AGEs誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷中的作用。
　　方法:在第一部分實(shí)驗(yàn)中:(1)應(yīng)用NLRP3基因敲除(NLRP3 KO)和野生型C57BL/6J小鼠，給予甘油醛來源的AGEs(Gly-AGEs)和BSA腹腔注射6周，測定葡萄糖耐量、胰島素釋放和胰島素耐量。收集標(biāo)本，HE染色觀察病理變化并行胰島炎評分，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，Tun

2、el染色測定胰島細(xì)胞凋亡，免疫熒光觀察胰島素、胰高血糖素、IL-1β、NLRP3和F4/80染色。Western blot測定胰腺組織NLRP3炎癥小體和MCP-1蛋白表達(dá)，比色法測定caspase1活性，ELISA測定MCP-1水平。(2)C57BL/6J小鼠Gly-AGEs腹腔注射6周，氯膦酸脂質(zhì)體(COLD-lip)注射清除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測，指標(biāo)同前。(3)應(yīng)用Gly-AGEs和不同干預(yù)措施（RAGE和NLRP3沉默

3、及抗氧化劑NAC）分別處理MIN6、小鼠原代腹腔巨噬和RAW264.7細(xì)胞。測定細(xì)胞活性，ROS，細(xì)胞凋亡以及葡萄糖刺激的胰島素釋放。Western blot或real-time RT-PCR測定RAGE、NLRP3、ASC、caspase1和MCP-1表達(dá)，比色法測定caspase1活性，ELISA法測定IL-1β分泌。
　　在第二部分實(shí)驗(yàn)中:(1) C57BL/6J小鼠分別腹腔注射BSA、Gly-AGEs和葡萄糖來源的AGEs

4、(Glu-AGEs)6周后，進(jìn)行相關(guān)檢測，指標(biāo)同前。(2)檢測孵育Gly-AGEs和Glu-AGEs后，NLRP3炎癥小體和MCP-1表達(dá)的變化。
　　在第三部分實(shí)驗(yàn)中:建立測定血漿中甲基乙二醛(MG)濃度的HPLC-MS/MS方法，并檢測初診T2DM患者血漿MG水平，評估MG和其它參數(shù)之間的關(guān)系。
　　在第四部分實(shí)驗(yàn)中:(1)NLRP3 KO和WT小鼠，給予甲基乙二醛來源的AGEs(MG-AGEs)和BSA腹腔注射6周，進(jìn)

5、行相關(guān)檢測，指標(biāo)同前。(2)應(yīng)用MG-AGEs和不同干預(yù)措施處理后，測定RAGE、ROS和NLRP3炎癥小體變化。
　　結(jié)果:(1)腹腔注射Gly-AGEs可誘導(dǎo)小鼠糖耐量損傷和糖負(fù)荷下胰島素釋放功能減低，并導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡增多，線粒體結(jié)構(gòu)改變。NLRP3 KO小鼠上述損傷減輕。(2) Gly-AGEs激活小鼠胰腺NLRP3炎癥小體，胰島中巨噬細(xì)胞浸潤增多，胰島炎評分增高。NLRP3 KO小鼠caspase1活性和IL-1β分泌

6、降低，巨噬細(xì)胞浸潤減少。(3) COLD-lip清除巨噬細(xì)胞后改善Gly-AGEs誘導(dǎo)的小鼠胰島功能和結(jié)構(gòu)損傷。(4) Gly-AGEs使MIN6細(xì)胞活力降低，ROS升高，細(xì)胞凋亡增多和糖刺激下胰島素釋放能力損傷。NLRP3基因沉默后上述損傷未能改善。(5)Gly-AGEs通過RAGE-ROS途徑激活巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體。(6) Gly-AGEs腹腔注射小鼠胰腺組織MCP-1蛋白表達(dá)和含量升高，NLRP3 KO小鼠部分減少。(7)

7、 Gly-AGEs和IL-1β孵育顯著上調(diào)MIN6細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)。IL-1ra阻斷IL-1β上調(diào)的MCP-1 mRNA表達(dá)。(8)Gly-AGEs激活巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤小鼠胰島的效應(yīng)較Glu-AGEs更強(qiáng)，對小鼠胰島β細(xì)胞損傷作用更為顯著。(9)初診T2DM患者血漿MG水平顯著升高，且血漿MG含量與HbA1c和MDA均成正相關(guān)。(10) MG-AGEs激活巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體。NLRP3 K